粪便中沙门氏菌测定试验设计

1、粪便中沙门氏菌测定试验设计试验编号：20181101试验人员：康慧鑫殷莉阳试验时间：2018年11月日-2018年 月 日试验地点： 山西农业大学病理实验室第1页共1页1试验目的与依据沙门氏菌属是人类和动物常见的一组肠道致病菌，是肠道传染性疾病流行 时，评价粪便无害化处理效果的主要指标。依据国标GB7959-2012规定的检测标准进行该项试验。.试验材料恒温培养箱(36虫)C厂家：上海智诚 型号:ZXGP-A2050恒温培养箱(44此5) C厂家：上海 BOXUN公司 型号:BZF-50高压蒸汽灭菌器厂家：HIRAYAMA型号:HVE-50双倍料缓冲蛋白陈水厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有

2、限公司 批号：HB4084氯化镁孔雀绿增菌液厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司批号:HB4092亚硫酸钿琼脂 厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司批号:HB4090三糖铁琼脂厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司批号:HB4088SS琼脂厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司批号:HB4089革兰氏染液 厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司批号:HB8278沙门氏菌属诊断血清厂家：宁波天润生物药业有限公司批号:20180101100mL锥形瓶12个、20mL试管24个、75mm平皿24个、天平、乳钵或均 质器、水浴箱、冰箱、平皿、10 mL移液枪、玻片、接种环(针)

3、、采样瓶、玻 璃珠。.试验方法培养基和试剂配制样品稀释液制备制法：将氯化钠溶解于去离子水中，分装到加玻璃珠的锥形瓶内，每瓶 90mL, 121C, 20min高压蒸汽灭菌。表1样品稀释液配制配方量取量氯化钠(g)去离子水(mL)氯化钠(g)去离子水(mL)8.5g1000mL第2页共2页双倍料缓冲蛋白陈水（BP）制备制法：将上述成分溶解于蒸储水中，调节 pH7.2,分装到内有玻璃珠的锥形 瓶中，每瓶90 mL, 121 C , 15min高压蒸汽灭菌。表2双料蛋白陈水配制配方量取量BP(g)去离子水（mL）BP(g)去离子水（mL）10g500氯化镁孔雀绿增菌液（MM）制备表3氯化镁孔雀绿增菌

4、液配制配方量取量MM(g)去离子水（mL）MM(g)去离子水（mL）1.550亚硫酸钿琼脂（BS）制备表4亚硫酸粒琼脂（BS）配制配方量取量培加至（g）去离子水（mL）培加至（g）去离子水（mL）5.03100注：此培养基为淡绿色，不需高压灭菌，制备过程不宜过分加热，以免降低 其选择性，应在临用前1d制备，贮存于室温暗处，超过 48h不宜使用。SS琼脂制备表5完全培养基配制配方量取量培加至（g）去离子水（mL）培加至（g）去离子水（mL）6.353100注：制备好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用。孔雀石绿 溶液配好后应在10d以内使用。三糖铁琼脂（TSL）制备制法：115C,

5、20min高压蒸汽灭菌，放置高层斜面备用。第3页共3页配方量取量培加至（g）去离子水（mL）培加至（g）去离子水（mL）6.45100表6三糖铁琼脂配制3.2样品采集、制备3.2.1样品采集粪稀样品采集：用无菌采样器、蠕动泵等，在三格化粪池、双翁池、沼气池 相应部位，采集贮粪池、沼气池内样品，样品量约 500mL,置无菌广口瓶内备 检。3.2.2样品制备粪稀等样品：取混摇均匀的粪稀10g或粪稀液10mL,置于带有玻璃珠的无菌锥形瓶内，加入90mL生理盐水（8.5g/L）,混摇3min5min,制成混悬液表7粪稀样品制备原编号配方量取量尿 A (g)N110生理盐水（mL）90N1生理盐水（mL

6、）尿 B(g)N210生理盐水（mL）90N2生理盐水（mL）尿 c (g)N310生理盐水（mL）90N3生理盐水（mL）水 a (g)S410生理盐水（mL）P 90S4生理盐水（mL）水 B(g)S510生理盐水（mL）90S5生理盐水（mL）3.3前增菌以无菌操作，取制备的混悬液10mL接种到90mL缓冲蛋白陈水（BP）,混 匀，置（36虫）C培养（18及）h 。表8前增菌样品制备配方量（mL）取量（mL）Q1N110BP90N1BPQ2N210BPr 90N2BPQ3N310BP90N3BPQ4S410BPr 90S4BPQ5S510BP90S53.4选择性增菌用无菌吸管吸取1mL增

7、菌液加入到9mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）中,置（44此5） C 培养 24h- 48h0第4页共4页表9选择性增菌样品制备配方量（mL）取量（mL）X1Q11MM9Q1MMX2Q21MM9Q2MMX3Q31MM9Q3MMX4Q4 n1MMr 9Q4MMX5Q51MM9Q5MM分离用接种环分别取选择性增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸钿琼脂平板（BS） 和一个SS琼脂平板，于（36土）C培养24h- 48h,观察各个平板上生长的菌落。判定标准：沙门氏菌在亚硫酸钿琼脂平板上的菌落特征为，产H2s菌落为棕褐色或灰色至黑色（BS具有强选择性，强烈抑制大肠类，略抑制沙门，需延长培养时间， 无乳糖指示系统

8、，有硫化氢指示系统。而且还原亚硫酸钿为硫化钿，产物为黑色 或褐色），有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色，不产H2s菌株呈灰绿色，周围培养基不变或微变暗；沙门氏菌在 SS琼脂平板上的菌落特征为，无色 半透明；产H2s菌株菌落中心程度不同的黑色（产生硫化氢，硫化氢与培养基 内的铁发生反应，这样生成黑色物质）；乳糖阳性菌株为粉红色中心黑色。若各 选择性平板上无可疑菌落生长，可直接报告未检出沙门氏菌。表10分离菌样品制备A口加工颜色特征X1DC铉关宜 BS A口-ZPyOOM关宜 SS A口-ZPyX2DC铉关宜 BS A口-ZPyOOM关宜 SS A口-ZPyX3DC铉关宜 BS A口-ZPyO

9、OM关宜 SS A口-ZPyX4DC铉关宜 BS A口-ZPyOOM关宜 SS A口-ZPyX5DC铉关宜 BS A口-ZPyOOM关宜 SS A口-ZG第5页共5页生化试验自选择性琼脂平板上用接种针直接挑取可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂斜面上，尽可能多的选择可疑菌落，少于5个菌落的平板，应全部挑取。置（36土）C 培养24h- 48h,观察结果。在三糖铁琼脂上，凡生化反应特征符合斜面为红色、 高层变黄，少量或中等程度产气，产或不产 H2s者，应继续进行血清学鉴定实 验，全部变黄或仍为红色者放弃。（本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面

10、先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接 触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质， 生成碱性产物，故使斜面后来 又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。）表11TSI培养结果记录样品编号培养结果是否符合TSL培养特性革兰氏染色取培养1824h三糖铁琼脂可疑阳性的斜面菌苔涂片，将涂片在火焰上固定， 滴加结晶紫染色液，染1min,水洗。滴加革兰氏碘液，染1min,水洗。滴加脱 色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s,水洗。滴加复染剂，复染1min, 水洗，待干，镜检。判定标准：显微镜下镜检应为革兰氏阴性短杆菌。表12镜检结果记录样品编号镜检是否为革兰氏阴性短杆菌第6页共6页血清学鉴定试验菌株要求：经生化检查的菌株，在普通营养琼脂培养基上3537C培养1820小时，获得的新鲜菌体方可用于血清凝集试验。于洁净的玻片的测试区域及对照区域分别滴 12滴血清及1滴生理盐水；然 后取少量菌苔与血清及生理盐水混匀，轻轻摇动玻片，1分钟内观察凝集现象（O 抗原为颗粒状凝集，H抗原为絮状或绒毛状凝集）。判定标准：于1分钟内明显凝集者为阳性，均匀凝集者为阴性。表13血