生物工程下游技术第2讲的课件

1、第二讲 光分析法导论一、光分析法及其特点光分析法：以物质的光学性质为基础建立的分析方法。凡是基于检测能量与待测物质作用后所产生的光辐射信号或所引起的变化的分析方法都属于光分析法。优势：研究物质组成、结构表征、表面分析及几何模型。三个基本过程： （1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。 基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。二光的性质及其与物质的相互作用1电磁波的种类：波长(nm)510-30.10.11010200200400名称射线x射线远紫外光近紫外光波长(nm)4007

2、507501.01061.01061.01091.01091.01012名称可见光红外光微波无线电波波长（）：表示相邻两个光波各相应点间的直线距离（或相应两个波峰或波谷间的直线距离）。 波数（）：指在单位长度内波的数目。 频率（）：指在1秒时间内经过某点的波数（即每秒内振动的次数）。 能量(E)：光子所具有的能量。表征电磁波特性的参数： 不同波长的光具有不同的能量：波长越长（频率、波数越低），能量越低；波长越短，能量越高。电磁波谱中：射线、x射线（粒子性）能谱能谱分析法微波、无线电波（波动性）波谱波谱分析法中间部分光学光谱光谱分析法复合光与单色光通常物质发出的光为复合光可采用一定方法获得单色光

3、 单色光的单色性用光谱线的宽度（或半宽度）表示，宽度越窄，单色性越好。例:日光中红色光的波长范围是640680nm，而金属钠蒸气所发射的黄色光波长范围是589.0589.6nm，光谱宽度仅为0.6nm，（谁的单色性好？）。然而，普通的氦氖激光器发射的波长为632.8nm的红光，其宽度却只有10-6nm。激光理想的单色光源！光学分析法中的光栅单色器一.棱镜单色器基本组成入射狭缝准直镜棱镜单色器聚焦物镜聚焦面出射狭缝二. 光栅单色器基本组成入射狭缝平面衍射光栅出射狭缝聚焦物镜聚焦面f准直镜二、光与物质的相互作用吸收：物质选择性吸收特定频率的光并使其强度减弱，物质内部的能量增加。分原子吸收、分子吸收

4、。(2)发射：受激物质以光的形式释放出多余的能量。分原子发射、分子发射及X射线。(3)散射：光通过不均匀介质时，一部分光沿其他方向传播，如：丁铎尔散射和分子散射。(4)折射：当光从一种透明介质进入另一种透明介质时，光束前进方向改变。色散现象单色光。物质对光的选择性吸收 M + h M *M + 热M + 荧光或磷光基态 激发态E1 （E） E2 E = E2 - E1 = h 分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同。 基态 激发态 E1 （E） E2M + 热M +荧光或磷光(5) 反射 光射到物体表面的时候，被物体表面反射改变方向。(6) 干涉 当频率、振动、周相相同的光源所发射的相

5、干光波互相叠加时，可以产生明暗相间的条纹。(7) 衍射 光绕过障碍物而弯曲地向后传播。干涉衍射现象，应用：分光，X射线衍射。(8) 偏振 天然光通过某些物质后，变为只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。三、光分析分类（一）光谱法 基于物质与辐射能作用时，原子、分子内部量子化能级之间跃迁而产生的光的发射、吸收或散射的波长与强度进行分析的方法。1、原子光谱（线性光谱）最常见的三种基于原子外层电子跃迁的： 原子吸收光谱（AAS） 原子发射光谱（AES） 原子荧光光谱（AFS） 基于原子内层电子跃迁的X射线荧光光谱（XFS）基于原子核与射线作用的穆斯堡谱原子光谱 线光谱 Line spectraN

6、a 589.0nm、589.6nmE2E0E1E3原子发射光谱原子吸收光谱波长hi半宽度10-210-52、分子光谱 带状光谱 Band spectra基于分子中电子能级、振-转能级跃迁： 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS） 核磁共振与顺磁共振波谱（N） 分子光谱分子发射光谱分子吸收光谱hi波长/nmI波长/nmA(T)E2E1E0半宽度20100nm半宽度20100nm（二）非光谱法 不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向等物理性质。利用光与物质作用时所产生的折射、干涉、衍射和偏振等变化来分析测定。主要有偏振法、干涉法、旋光法

7、、圆二色性法等。 光分析法光谱分析法非光谱分析法折射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法原子光谱分析法分子光谱分析法 光谱分析法吸收光谱法发射光谱法原子吸收紫外可见红外可见核磁共振原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光光谱分析法的分类1、按产生光谱的物质类型分： 原子光谱、分子光谱和固体光谱2、按产生光谱的方式分： 发射光谱、吸收光谱和散射光谱3、按照光谱的性质和形状分： 线光谱、带光谱和连续光谱）吸收光谱：物质受到光辐射作用时，物质中的分子或原子以及强磁场中的自旋原子核吸收了特定的光子后，由低能态被激发跃迁到高能态，将吸收的光辐射记录下来得到的即吸收光谱。 可分为分子吸收光谱、原

8、子吸收光谱及核磁共振波谱 ）发射光谱：物质中的粒子用一定的能量（如光、电、热等）激发到高能级后，当跃迁回低能级时，便产生出特征的发射光谱。 可分为原子（离子）发射光谱、分子发射光谱和X射线发射光谱。）散射光谱法：利用物质对光的散射来进行分析的方法。 瑞利散射（物质与光发生弹性碰撞） 拉曼散射（物质与光发生非弹性碰撞） 拉曼散射光谱光谱形状1、线光谱: 由若干条强度不同的谱线和暗区相间而成的光谱。（原子光谱）2、带状光谱: 由几个光带和暗区相间而成的光谱。 （分子光谱）3、连续光谱： 在一定范围内。各种波长的光都有，连续不断，无明显的谱线和谱带。 炽热的固体物质及复杂分子受激后发射出的是波长范围

9、相当广阔的连续光谱，称为固体光谱。自然界的连续光谱实验室的连续光谱实验室的连续光谱电磁波谱与现代仪器分析方法波谱区-射线波长5140 pm跃迁类型核能级X-射线远紫外光10-310nm10200nm原子内层电子近紫外光可见光200400nm400750nm原子外层电子/分子成键电子莫斯鲍尔光谱法:-射线原子核 -射线吸收远紫外光-真空紫外区，此部分光谱会被空气吸收X-射线吸收光谱法: X-射线/放射源原子内层电子（n10) X -射线吸收X-荧光光谱法: X-射线原子内层电子 特征X -射线发射原子光谱：原子发射光谱、原子吸收光谱、原子荧光光谱分子光谱：紫外-可见吸收光谱、分子荧光/磷光光谱、

10、化学发光波谱区近红外光中红外光波长0.752.5m2.550m跃迁类型分子振动远红外光微波射频501990m0.1100cm1100 m分子转动电子、核自旋近红外光谱区:配位化学的研究对象红外吸收光谱法:红外光分子吸收远红外光谱区电子自旋共振波谱法:微波分子未成对电子吸收核磁共振波谱法:射频原子核自旋吸收光分析法仪器的基本流程光谱仪器通常包括五个基本单元：光源单色器样品检测器显示与数据处理光学分析法中的检测器一. 光电转换器（Transducer）二、光电倍增管（photomultiplier tube, PMT） 光的吸收定律1.朗伯比耳定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后

11、于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系： Ab1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：Ac二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为： AKLc AKLc 式中， A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度 L：液层厚度(光程长度)，常以cm为单位 c：吸光样品的浓度，单位molL-1； K：摩尔吸光系数（k），单位Lmol-1cm-1， k在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；透光度(透光率)T吸光度A与透光度T的关系: A lgT 透光度T : 描述入射光透过溶液的程度: T = It / I0

12、朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据，应用于各种光度法的吸收测量。偏离朗伯比耳定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。 (1). 由于入射光不是单色光而引起的偏离 目前各种方法所得到的入射光是具有一定波长范围的波带，而非单色光，因而发生偏离朗伯一比耳定律的现象。单色光的纯度愈差，吸光物质的浓度愈高，偏离朗伯-比耳定律的程度愈严重。在实际工作中，若使用精度较高的分光光度计，可获得较纯的单色光。 (2). 由于介质的不均匀性引起的偏离 当被测溶液是胶体溶液、悬浊液或乳浊液时，入射光通过溶液后除一部分

13、被吸收外，还有一部分因溶液中存在微粒的散射作用而损失，并使透光度减小。而当胶体或其他微粒凝聚沉淀时，又会使溶液吸光度下降。(3). 溶液中的化学变化引起的偏离 溶液中的化学变化如缔合、离解、溶剂化、形成新的化合物、互变异构等，使吸光度不随溶液浓度成正比地改变，而导致偏离朗伯比耳定律。 例如，重铬酸钾在弱酸性介质中有如下平衡： Cr2O72- +H2O 2HCrO4- 在450nm波长处测量不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度。由于在浓度低时重铬酸根的离解度大，而浓度高时离解度小，同时由于K(HCrO4-) K(Cr2O72-) ，因此低浓度时重铬酸根离子的吸光度降低十分显著，这就使工作曲线偏离朗伯和耳定律。光分析方法的进展1. 采用新光源，提高灵