长春新碱的发酵培养

1、长春新碱的发酵培养摘要：长春新碱是从抗癌中药长春花叶中提出的二聚 吲哚类生物碱，临床上用于治疗急性淋巴细胞、何杰 金及非何杰金淋巴瘤的确有效果。但是在植物中提取 困难，就采用发酵的方法大量合成。关键词：长春新碱；抗癌；内生菌；发酵前言长春花为夹竹桃科植物的全草，具有较高的药用 价值1。迄今已经分离出70余种生物碱，其中以长春 新碱和长春碱最具有价值。长春新碱是重要的抗癌药 物之一，尤其对白血病具有显著疗效，通过干扰癌细 胞纺锤体形成，使细胞有丝分裂停止于中期，从而阻 断癌细胞的扩散。其主要来源一直是从长春花植物中 提取。但此种生物碱在长春花中含量低，而合成和半 合成又比较困难，长春花的细胞组织

2、培养虽已成功， 但有效药用成分含量太低，成本高，生产难度大，也 未能实现工业化生产1。真菌因其易于培养，方便控 制，生长快，还可以通过育种手段和控制培养条件等 措施大幅度提高其有效成分含量与组织化生产等特 点，有着广阔的应用前景。1长春新碱的理化性质游离的长春新碱为片状结晶，极不稳定，因此常用 其硫酸盐。其盐为白色或类白色的结晶粉末，无臭， 有吸湿性，遇光或热易变黄，熔点为218220度，在 水中易溶解，在甲醇或氯仿中能溶，在乙醇中微溶。2长春新碱的药理研究在细胞周期S期，VCR与微管蛋白结合，从而使 中期细胞分裂停止，导致有丝分裂中的细胞群体明 显增加，使细胞分裂停止于M期，因此是M期细 胞

3、周期特异性药物。长春新碱在明显抑制人慢性骨 髓性白血病K562细胞增殖的同时显著降低细胞膜 磷脂酰肌醇激酶的活性，提示降低PIK活性是其 影响细胞核酸或蛋白质代谢，进而抑制细胞增殖的 早期生化过程之一。急性淋巴细胞白血病(All)采用VCR体外骨髓净化与自体骨髓移植结合治 疗ALL是目前最新的方法。施红等刃发现长春新 碱和甲基泼尼龙联合应用对急性淋巴细胞白血病 细胞系和淋巴瘤细胞系细胞的净化效果比单用 VCR效果显著。胃癌长春新碱对胃癌的抑制率较高，且其抑制率有随 药物浓度增加、作用时间延长而增高的趋势。肝癌汤为学等观察在体外顺铂、5-Fu、长春新碱3种抗 癌药物单用或者合用对人肝癌细胞株的相

4、互作用。3 种药物单独应用及两药合用时随着药物剂量增加效应 也增加，两药大剂量合用时产生拮抗作用，小剂量合 用时可产生协同作用，且效应大小与两药浓度比例及 给药时间次序有关。这就可通过联合用药来降低VCR 用量而达到高效。卵巢癌长春新碱是新进用于卵巢癌的化疗药物，但研究 表明卵巢癌对VCR产生较高水平的耐药，以往的 临床资料也显示VCR对卵巢癌的临床缓解率仅为 14% 左右5.长春新碱在植物体内含量极低，仅为百万分之几， 分离提取困难，且植物生长缓慢，资源短缺，故限制 了该药的进一步开发利用。因此，寻找长春新碱的药 源，已成为摆在人类面前的一项重大的研究课题。近 年来国内外学者主要从3个方面来

5、探索这类课题，即 化学合成法、植物细胞及组织培养法和微生物发酵法。 目前人们普遍认为微生物发酵法是一种最具潜力的方 法。由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重要 影响，甚至会产生和其寄主相同或相似的生理活性成 分，而且，真菌易于培养，可以通过育种手段和控制 培养条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量，并 便于组织工业化生产。故利用微生物生产抗癌成分的 对比为以后筛选真菌来生产药物奠定基础。3材料和方法3.1材料:新鲜长春花3.2培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏培养 基、改良的MM培养基。3.3内生真菌的分离：按常规无菌操作。取长春花不 同部位的叶和茎十，按下列程序表面消毒：自来水冲

6、 洗f 75%酒精漂洗（3-5min）f无菌水冲洗3-4次f 0.1%升汞漂洗（10-30s）f无菌水冲洗5次。将上述处理过的叶片和茎在超净台条件下切割成 约05cmX0.5cm的小片（茎取韧皮部），然后将小片 种植于PDA平板上，置28度温箱培养3-7d后，即可 见样品切割过的边缘有菌丝长出，经纯化后转接到 PDA斜面上备用。为检查表面消毒是否彻底，可做对照试验，将 上述同样处理过的茎叶不做切割，直接种植于PDA 平皿上，置于相同的条件下培养，结果对照的茎段 周围物任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到 的菌是韧皮部内部的，不是表面的附生菌。3.4内生真菌的液体培养液体培养基为基本培养基（M

7、M）,将1000ml培养液 分装在250ml的三角瓶中。用接种钩挑取少许菌丝接 种于培养瓶中，置于27度摇床（100r/min）培养3-4d, 待菌丝体长好后进行提取。3.5提取方法：发酵液1000ml-碱化（PH大于8）- 离心（2500r/min）-沉淀一加CHCL3-浓缩一置青霉 素小瓶中备用。3.6检测方法3.6.1 TCL检测硅胶板。展开剂；苯：丙酮=8:2；显 色采用碘显色。3.6.2液相色谱分析微生物产生与植物一致的次生代谢产物的可能性 分析：生物在次生代谢过程中其生化途径的连续演化 会导致有益物质进入到共生体中，其基本的生化过程 信息有时还会传递到其它生物中去，在生物早期的系 统发育过程中，一些具有完全互补的遗传特性或参与 代谢过程的其它生物体（如细菌或蓝藻），被认为可以 组合进真核细胞并发育成线粒体和叶绿体7。参考文献中国科学院植物研究所编.中国高等植物图鉴.北京: 科学出版社,1985:430.郑珍贵，刘涤，胡之壁.长春花细胞大规模培养生产生 物碱的研究现状国外医药，植物药分 册.1966,11(5):204-208.施红，严文伟.长春新碱联合甲基泼尼龙体外净化 淋巴细胞白血病细胞的实验研究中华血液学杂 志,1994,15(10):526.艾军，何兰欣,梁索源，等.抗癌药物对体外胃癌细 胞生长的抑作用.河北医科大学学报,2002,