重组人生长激素USP35

1、重组人生长激素FPTIPLSRLFDNMLRAHRLHQLAFDTYQEKYSFLQPQTSLCFSESIPTPSNRBETQQKSNLELLF.ISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGR-LEDGSPRTGCIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKWGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFC990H1528N262O300S722，125口2629-。1-5.胺溶液，用盐酸调节pH至7.5。胰蛋白酶溶液一用Tris缓冲液制备 1mg/ml胰蛋白酶溶液，混匀，如有必要， 冷冻保存。标准溶液一用Tris缓冲液制备2

2、.0mg/ml USP重组人生长激素标准品，混匀。取1ml 置于适当容器中，添加30四1胰蛋白酶溶液， 扣盖，置于37水浴4小时。注意：如不 立即上样，置于冰箱中保存。供试溶液一用Tris缓冲溶液制备时间（min）溶液A（%）溶液8（%）洗脱0 - 20100 今 800今20线性洗脱20 - 4080 今 7520 今 25线性洗脱40 - 6575 今 5025 今 50线性洗脱65 - 7050 今 2050 今 80线性洗脱70 - 7120 今 10080今0线性洗脱71 - 861000等度，再平衡重组人生长激素是一种191个氨基酸残 基组成的由人垂体产生具有促生长作用的 蛋白质。

3、可通过基因重组技术生产其冻干粉 和水溶剂。其冻干粉制剂中含量应不少于 910四g/mg重组人生长激素。其水溶剂每mg 总蛋白量中含重组人生长激素应不少于 910明。重组人生长激素中的宿主细胞DNA 和宿主细胞蛋白残留限度标准需经被验证 的方法确认。生产企业必须采用基于促生长 且经主管部门认可批准的经验证的生物测 定方法证明其生物效价，可包含其赋形剂。 注：每mg无水重组人生长激素相当于3.0 USP单位包装和贮存一密封容器中-10-25 C储存。 标签一标签应注明重组DNA起源。USP参照标准11USP内毒素RS; USP重组人生长激素RS 鉴别一A：取适量USP重组人生长激素标准品， 用稀释

4、液配制成浓度为2.0mg/ml的标准溶 液。其余参照色谱纯度检查项下进行，用色 谱程序分析标准品溶液和供试溶液：供试溶 液色谱图中重组人生长激素主峰保留时间 应与标准溶液一致。B：肽图（参见生物制品检测方法1047） 溶液A一制备三氟乙酸水溶液（1:1000, v/v），过滤，脱气。溶液B量取100ml水加到1000ml容 量瓶中，再加1ml三氟乙酸，最后用乙腈溶 液稀释至终体积，并混匀。流动相一溶液A和溶液B的变量混合液 为色谱系统流动相。必要时可调整任一溶液。（参见色谱系统适应性621）Tris缓冲液一配制0.05Mtris（羟甲基）甲2.0mg/ml 重组人生长激素溶液，混匀。取 1ml

5、置于适当管内，加30gl胰蛋白酶溶液， 扣盖置于37水浴4小时。注：如不立即 上样，置于冰箱中保存。色谱分析系统（参见色谱分析方法6217）配备 214nm 检测波长，4.6mmX 25cm色谱柱，包括填充 L7，流速为 1ml/min，温度30。色谱分析程序如下：方法一注:色谱系统条件在上样之前优 先运行空白梯度洗脱程序分别进样相同体 积（约100W）的标准品溶液和供试溶液， 记录色谱图：供试溶液色谱图与标准品色谱 图相似。生物鉴定一生物鉴定实验可依据重组人生 长激素原料药或其制剂执行缓冲液一配制0.1M碳酸氢铵溶液，用 氢氧化钠调节pH至8.0。标准溶液一取适量USP重组人生长激 素标准品

6、，用缓冲溶液溶解并稀释制成浓度 为10100pg/ml溶液。供试溶液用缓冲溶液溶解重组人生 长激素并稀释至于标准溶液相似浓度。注： 轻轻旋转，不可震动混匀空白对照溶液一缓冲溶液。实验动物一选择一定数量单一雌性或 单一雄性的25到30天大脑垂体切除的斯普 拉格-杜勒鼠。小鼠垂体切除后，饲喂鼠粮和5%葡萄糖溶液超过7小时。72小时后， 饲喂小鼠鼠粮和用1N盐酸调节pH至3.0 + 0.25的已过滤去离子水。从第37到44天对 小鼠称重，仅记录健康小鼠体重，7天以后 再次称重，选择其中健康且在7天周期内体 重增减不超过10%的小鼠。方法一随机将上述小鼠分为空白组，对 照组和测试组，每组10只。每天分

7、别对空 白组，对照组和测试组注射0.1ml的空白液， 标准溶液和供试溶液，共10天。记录每只 小鼠在实验开始和第10天注射18小时后的 体重。运用统计学方法计算供试组相对标准 组10天周期内体重变化差异。计算每mg 相当USP重组人生长激素活力单位：结果每 mg应不少于2个单位。相对效力95%的对 数评价置信区间宽度（L）。L不大于0.40， 效力置信极限应符合63%-158%之间。若L 大于0.40，重复该实验俩次或多次，结合适 当统计分析方法直至满足此规范。微生物限度检测61 和特定微生物检测62 精确称取0.2到0.3g样品进行检测，好氧 微生物总数不得超过300cfu/g。细菌内毒素8

8、5每mg不超过10USP EU。 水分，方法Ic921不超过10%，以冻干 粉供试。色谱纯度检查一稀释液一制备0.05MTris溶液，用盐酸 调pH至7.5。流动相一稀释液与正丙醇按体积比混 合（71:29 v/v），如需调整（参见色谱分析 系统适应性62）分离度溶液：用稀释液配制浓度为 2.0mg/ml的重组人生长激素溶液或添加 0.01%终浓度的叠氮化钠，然后室温放置24 小时。注：配制后48小时内使用，或冷藏 保存供试溶液一用稀释液配制2.0mg/ml重 组人生长激素溶液（现用现配）注：溶液 维持在2-8，24小时内使用，若使用自动 进样器，应维持在2-8色谱分析系统（参见色谱分析方法

9、621）配备 220nm 检测波长，4.6mm X 25cm色谱柱，包括填充L26,温度控制45C， 流速为0.5ml/min。分析分离度溶液，记录 峰响应。重组人生长激素主峰与邻近峰之间 分离度R不小于1.0，拖尾因子0.9-1.8。方法：上样2.0%记录色谱图，测量 峰响应值，根据下列公式计算重组人生长激 素杂质峰百分比。100AI/（AI+AS）其中AI除重组人生长激素主峰及溶剂 可忽视峰的其它所有峰响应值。气为重组人 生长激素主峰响应值，结果总杂质峰不得超 过 6.0%。高分子量蛋白一磷酸缓冲液，流动相，稀释 液，分离度溶液和色谱系统参照含量测定项 下进行。供试溶液参照含量测定供试液准

10、备。方法一取供试溶液20gl上样，记录色 谱图，测量主峰和主峰之前除溶剂峰以外的 峰面积。根据下公式计算重组人生长激素中 高分子量蛋白的百分比。100Ah（Ah+Am）其中，Ah为高分子量峰面积总和。Am 为供试液色谱图单体峰面积：高分子蛋白不 得超过4%。总蛋白一（参见分光光度法851）磷酸缓冲液一配制0.025M磷酸二氢钾 溶液，用氢氧化钠调pH至7.0。供试溶液精确称量重组人生长激素 于适量缓冲液中，溶解并稀释成在最大吸收 波长（280nm）吸光度为0.5-1.0之间的溶液。方法一用1cm分光光度计比色池测定 供试液在最大吸收波长（280nm ）和320nm 波长的吸光度，磷酸缓冲液作空

11、白对照。根 据下公式计算重组人生长激素总蛋白量 (mg)。V (A-A max320)/0.82其中V为供试溶液体积，Amax和A320分 别为供试溶液在最大吸收波长和320nm波 长的吸光度。含量测定一磷酸缓冲液一称量无水磷酸二氢钠 5.18g，磷酸二氢钠3.65g，加水950ml，用 磷酸调节pH至7.0，加水至1000ml。流动相一磷酸缓冲液与异丙醇按比例 混合（97:3 v/v）可适当调整（参见色谱分 析方法系统适应性621）。稀释液一水和磷酸缓冲液1.5:1比例混 合。分离度溶液一取一小瓶USP重组人生 长激素标准品置于50C烘箱中12-24小时。 从烘箱中取出，用稀释液溶解并稀释至

12、浓度 约1mg/ml，其中包含二聚体1%-2%。标准品溶液一取适量USP重组人生长 激素标准品用稀释液配制成浓度为 1.0mg/ml的溶液。供试溶液一精确称取适量重组人生长 激素溶解于稀释液中，或用稀释液稀释一重 组人生长激素溶液，制成浓度约1mg/ml注: 如需要，可参照总蛋白量检测实验确定蛋白 总量。色谱分析系统一（参见色谱分析方法 621）色谱分析配备214nm检测波长， 7.8nmX30cm色谱柱，填充L33，室温，流 速0.6ml/min。记录峰响应，分析分离度。 分离度R （取决于峰谷比，二聚体和单体峰 之间峰谷高度与二聚体峰高之比）不得超过 过0.4，单体峰拖尾因子（主峰）不得超

13、过 1.7。方法一分别上样相同体积（约20 G标 准液和供试液，记录俩次重组人生长激素单 体峰（主峰）的保留时间，测量单体峰响应 值，根据下公式计算供试品中重组人生长激 素的含量（mg/ml）。CS（ru/rs）其中CS为USP重组人生长激素标准品 溶液浓度；ru和rs分别为供试液和标准液单 体峰响应值。USP参照标准11一USP内毒素RS; USP重组人生长激素RS 鉴别一参照重组人生长激素鉴别项下要求 进行。生物鉴别一参照重组人生长激素生物鉴别 项下要求进行。注：如果注射用重组人生 长激素粉末经过验证并符合要求，那么不需 要完成此实验细菌内毒素85 每mg重组人生长激素不 超过 20 US

14、P EU。无菌85参照无菌产品薄膜过滤检测要 求。色谱纯度检查一参照重组人生长激素项下 色谱纯度检查方法进行，总杂志峰不超过12%。高分子量蛋白一参照重组人生长激素高分 子量检测方法进行，除实验试剂外，高分子 量蛋白不超过6%。含量测定一磷酸盐缓冲液，流动相，稀释液，分离 度溶液，标准品溶液，色谱系统参照重组人 生长激素含量测定项下进行。供试溶液一用稀释液配制成浓度为 1mg/ml生长激素溶液于适当尺寸容器内。方法一参照重组人生长激素项下进行， 根据下公式计算每剂量中重组人生长激素 含量（mg）C （V/N） （ru/rs）公式中C为USP重组人生长激素标准品溶液浓度（mg/ml）； V为供试溶液总体积； N为供试溶液的剂量数；ru和