研究生课程-分子生物学-专题篇

1、3.专题篇第十九章基因诊断基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在，结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基本原理：检测DNA或RNA的结构变化与否、量的多少及表达功能是否正常， 确定受检者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病诊断的依据。意义：不仅能对疾病作出早期和确切诊断， 而且能确定个体对疾病的易感性及疾 病的分期、分型、疗效监测、预后判断等。第一节基因诊断的技术方法常用的分子生物学技术（一）核酸分子杂交包括 Southern blot; Northern blot; dot blot; in situ hybridization 等（二）聚合酶链式

2、反应（PCR）常与其他技术联合应用（三）单链构象多态性检测（SSCP; single strand conformation polymorphism）是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与 PCR联用, 称PCR-SSCP PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。（四）限制酶酶谱分析限制性片段长度多态性（RFLP； restrict fraction length polymorphinsm） （五）DNA序列测定是进行基因突变检测最直接、最准确的方法，不仅可确定突变的位置，而且可确定突变的性质。（六）DNA芯片技

3、术实际上是一种快速、敏感、高效、自动化的核酸杂交技术基因诊断的基本方法特点：1:特异性强检测特异性高达100%.早期诊断.灵敏度高检测灵敏度达毫微微克（fg）水平.取样方便任一有核细胞均可作为检测样品（一）基因突变的诊断1、点突变的诊断（1）已知的点突变可采用PCR/ASO （等位基因特异性寡核甘酸；allele specific oligonucleotide）探针法检测。（2） 未知的突变PCR-SSCRDNA序列测定；DNA芯片技术；等2、少数核甘酸缺少或插入探针法3、大片段丢失或插入PCR; 多重PCR （因为常规PCR扩增2kb以上的片段比较困难）4、基因重排（染色体易位）PCR;

4、原位杂交（包括FISH）;5、基因扩增Southern blot （先用酶切，再作 blot）（二）多态性分析1、RFLP分析（1）限制酶酶谱直接分析法（2） RFLP间接分析法2、DNA重复序列多态性分析（三）基因表达异常的诊断1、mRNA相对定量分析(1)斑点或狭缝杂交(2) RT-PCR2、mRNA绝对定量分析RT-PCR魔争性PCR3、mRNA长度分析Northern blot(四)外源DNA检测血清学等方法不够灵敏或特异，考虑用核酸分子杂交或PCR等技术，应用基因特异性探针或合成特异的寡核甘酸引物来检测。第二节月中瘤的基因诊断一、月中瘤基因诊断的策略1、检测月中瘤相关基因2、检测月中

5、瘤相关病毒的基因3、检测月中瘤标志物基因或mRNA第二十章基因治疗基因治疗一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改 变特殊疾病状态为目的的治疗方法。基因治疗的主要策略基因置换 (gene replacemen城称基因矫正 (gene correction)： 特定的目的 基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原 有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。基因添加或称基因增补(gene angmentation ：通过导入外源基因使靶细胞 表达其本身不表达的基因。基因干预(gene interference：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或 者通过

6、破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。基因置换或基因添加的必要条件对导入的基因及其产物有详尽的了解外来基因能有效地导入靶细胞导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留导入基因能有适度水平的表达基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害导入自杀基因一一细胞自杀效应将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化 为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞 自杀”，清除月中瘤细胞。基因修饰一一改变细胞功能基因修饰月中瘤细胞的 疫苗”疗法基因修饰TIL的过继免疫方法免疫增强基因疗法原位修饰月中瘤免疫原性的基因疗法基因标记(gene labeling)：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直

7、接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信 息。基因治疗基本上涉及三步基因导入(administration)：把基因或把含有基因的载体导入机体。基因传递(delivery):基因从导入部位进入靶细胞核。基因表达(expression：细胞中治疗性基因产物的形成。理想的基因治疗载体具备的性质易于进入靶细胞。在特异细胞或组织达到有规律、充分及持续的外源基因表达。外源基因应含或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。整个过程应安全有效并具有选择性。易于大量生产。基因治疗载体的选择（考虑因素）靶细胞或靶组织疾病类型期望是否持续或短暂表达所要求的基因表达水平体内或回体基因治疗安全性

8、：风险效应比。病毒载体具备的条件携带外源基因并能包装成病毒颗粒介导外源基因的转移和表达对机体不致病病毒载体类型重组型病毒载体：以完整的病毒基因组为改造对象，选择性删除病毒的某 些必需基因（早期基因、控制表达的基因），缺失的功能由互补细胞反式 提供；利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入病毒基因组的非必需 区，不改变病毒复制和包装所需的顺式元件。无病毒基因的病毒载体：由载体质粒和辅助系统组成。载体质粒：由外源 基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成； 辅 助系统：由病毒复制和包装所必需的反式作用元件组成逆转录病毒载体优点：高效地感染分裂的宿主细胞（100%）;在感染后，逆

9、转录病毒能够 将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；利用重组逆转录 病毒能将目的DNA传递给整个细胞群体；逆转录病毒载体可感染多种人 和动物的细胞，宿主范围非常广；不产生任何有免疫原性的病毒蛋白， 对 宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。缺点：只能整合至分裂相的细胞；容量小（不超 10kb）；病毒滴度不高； 由于其随机整合，有激活癌基因的潜在危险。腺病毒载体优点：转染效率高、安全；宿主范围广，与细胞分裂无关；容量大，制备 较易，病毒滴度较高。缺点:不能整合到染色体，表达时间短暂（1-6周）;具有免疫原性；反复治疗效 率降低;缺陷病毒可与宿主基因组或其它病毒发生重组

10、，产生危险系数高的 新病毒腺相关病毒优点:是非病原微生物，未发现野生型AAV与人类疾病有关；它既能感染分 裂细胞，又能感染非分裂细胞；宿主范围广，能感染多种宿主细胞；插入突变 的危险性相当低。缺点：只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；整合时 需要辅助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；很难大量生产。单纯疱疹病毒载体优点：HSV载体能携带30-50kb的外源基因，可在多种细胞中复制；能感 染分裂和非分裂细胞，对神经细胞易感。缺点：病毒不能整合入宿主细胞染色体，只能短暂表达；对感染的细胞产 生毒性作用。基因治疗的非病毒载体非病毒方法是依赖细胞机制将 DNA导入细胞进而转移至细胞

11、核。与病毒载体相比非病毒载体的优点：对受转移的DNA大小没有限制；DNA 容易进行操作，对于包装与复制需要的病毒序列没有特殊要求；比构建的病毒载体安全，不可能诱发任何感染；免疫源性问题少。理想的非病毒DNA传递系统应具备的性质：已知结构及成分在生物液体中，传递系统的稳定性受到复合物成分的控制细胞摄取受细胞特异性浆膜受体的控制能迅速从内容泡中释放(依赖于 pH值)能有效地脱包膜并经细胞质运输 DNADNA的核摄取充分能达到所期望的持续表达核酶(ribozyme )RNA组成的酶可催化RNA切割和RNA剪接反应。结构：锤头状和发夹状。具有催化RNA切割的核酶可作为基因表达和病毒复制的抑制剂，目前已

12、被开发用于基因治疗。三链 DNA (triple-strand DNA )当某一 DNA或RNA寡核甘酸与DNA高喋吟区结合时可形成三链。三链形成寡核甘酸(triple-forming oligonucleotide , TFO)能特异地结合在DNA大沟中，并与富含喋吟链上的碱基形成 Hoogsteen氢键。TFO与靶DNA的结合具有高度序列特异性，这是三链DNA的应用基础。TFO的作用机制：基因调控区形成三链 DNA后抑制基因转录基因治疗的疾病遗传病的基因治疗在DNA水平明确其发病原因及机制必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传该基因的表达不需要精确调控该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达

13、并发挥其生理作用该遗传病不经治疗将有严重后果月中瘤基因治疗基因干预技术：反义RNA; RNA干扰；反义基因自杀基因治疗：免疫基因治疗：细胞因子基因治疗；MHC基因治疗提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏；耐药基因的相关治疗联合基因治疗：自杀基因；免疫因子基因；抑癌基因；自杀基因与细胞因子基因；抑癌基因与免疫因子基因；病毒性疾病的基因治疗诱导对病毒RNA的降解：抑制病毒与宿主细胞的结合：干扰病毒基因组的转录起始和调控：抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成：RNA干扰技术：基因治疗的前景与问题基因治疗中所用的各种启动子，在不同种类的体细胞中表达效率是不同的。基因治疗研究中，体外基因转移是一个重要的研究

14、领域， 人体细胞在体外进行长期培养和繁殖，细胞的生物学改变是值得研究的问题。要有效和简便地将基因治疗应用于临床，需要发展体内基因转移方法。导入外源基因对肌体的不利影响也是一个不容忽视的问题。第二十一章药物相关的分子生物学研究 一、创新药物在临床治疗中此前尚未应用的药物（包括新品种、新剂型、新用途、新作用机制等）。二、基于靶点和机制的药物设计现代研究和开发创新药物的基础是寻找有效可行的干预靶点研发策略：在阐明疾病发生机制和获得干预靶点的基础上，再行合理的药物设计（根据药理学作用机制和构效关系等筛选并确定先导化合物）。三、分子生物学研究促进新药的研究分子生物学技术促进药物靶点的发现和验证。药物作用

15、靶点：具有重要生理或病理功能，能够与药物相结合并产生药理作 用的生物大分子及其特定的结构位点。一种疾病可有多个药物作用的靶点某一靶点也可以是多种疾病共同的治疗靶点（一）微阵列技术在大规模筛选和发现靶点中的应用1、核酸微阵列2、蛋白质微阵列3、组织和细胞微阵列组织芯片技术：在原位针对不同样本中的同一实验指标进行检测。（二）蛋白质组学研究可提供药物干预新靶点1、疾病相关蛋白质组学研究2、耐药病原体的蛋白质组学研究3、信号转导分子和途径的蛋白质组学研究（三）生物信息学在挖掘和预测药物干预新靶点中的作用生物信息学：以大量的生物信息，尤其是人类基因组的大量原始数据为对象， 应用计算机技术、结合其它学科知识，对原始信息进行整理、计算和开发利用。（四）RNNF涉技术用于发现和验证新靶点1、反义寡核甘酸2、RNAF扰四、组合化学和高通量筛选发现先导化合物1、先导化合物或模型化合物的发掘2、先导化合物优化3、候选药物的药理学和安全性评价4、高通量筛选技术应用是药物大规模筛选的趋势第三节基因药物将具有治疗意义的DNA重组入真核表达载体，直接转移到人体细胞，在体内表达 出具有治疗作用的多肽和蛋白质；或应用直接作用于细胞内的DNM RNA抑制基 因复制和表达的核酸片段或基人工合成的类似物，以及对