运用超滤和纳滤技术分离纯化苄青霉素

1、运用超滤和纳滤技术分离纯化苄青霉素摘要：本文主要是评估超滤和纳滤技术分离苄青霉素的效果。具体的说，我们证实三种滤膜对 分离杂质很有效果(5000, 30,000 and 100,000 Da)。在化学提取抗生素的过程中容易引起稳定乳 状液。我们还测试了在纳滤过程中(截留量300 Da)通过降低培养液的离子电荷来降低的渗透 压从而保持苄青霉素的渗透。结果表明，高回收率(89.0-91.0%),可以由30,000和100,000 UF 膜产生的渗透来获得，但有轻微的乳液会在第一阶段5000 UF膜形成，降低回收率(81.0% ), 但没有乳状液的产生，从而导致高的溶剂提取的产率(94.6%)。30

2、,000和100,000超滤纳滤渗 透导致非常高的回收率(98.0%)，但有稳定的乳状液形成，降低了化学提取率(80.0-82.6%)。 对于5000UF纳滤渗透，抗生素的回收率为(97.4%)，从而导致高提取率(92.4%)，没有形 成乳液。超滤过程应该应用到渗滤步骤，以增加抗生素的浓缩回收率。刖曰：发酵法生产抗生素的一个主要问题是分离和纯化这些分子。根据Gossele et al. (1989),统计纯化 费用占总产品花费的20-50%。重要的步骤有，分离菌丝体，化学提取活性物质，物质的结晶。 最为重要的就是化学提取水平，常常会形成乳状稳定液。这些稳定液大体上是混合蛋白，传统的 离心或者依

3、靠重力的技术是无法分离它们的。这种现象最终将导致最终产品受污染，低的提取产 量，在提取液体培养基时造成高的溶剂损失以及堵塞提取和分离设备。最有效的解决此类问题的 技术就是超滤技术。通过使用抗乳化产品或者使用聚凝剂，液体发酵培养基大部分体积可以被分 离。一些学者也用微孔滤膜过滤纯化培养基和细胞产物，但是它们去除固体蛋白的能力是有限的， 以为它们的截留分子量太大而不能保证大部分的蛋白质材料被过滤。抗生素技术可以结合反渗透 浓缩抗生素培养基，可减少苄青霉素的损失以及对高体积浓缩系数的液体具有高的抗生素回收率。关于纳滤分离抗生素的研究相对比较少。这一膜技术与反渗透提取有机分子相比具有很多优势。 首先在

4、使用纳滤技术时需要运行压力相对很低，可以减少经济成本。第二点，纳滤的膜孔相比于 反渗透膜稍大，能够增加渗透通量，因此减少操作时间。考虑到很多抗生素如青霉素对水解比较 敏感所以过滤时间就成为重要的临界因素，因而让其具有潜在的可使用性。最后，纳滤技术可增 加浓缩液中有机分子的纯度，去除了很多无机离子。实际上，大多数纳滤膜都可以部分透过阴阳 组分，降低了浓缩液的电导率，这一点可能有助于减少渗透压，相比于反渗透技术可促进相对低 的操作压力。本文研究表明超滤和纳滤技术可以结合用于提高苄青霉素产率。此为，我们比较了超滤膜的不同 分子截留量为了评价它们去除蛋白质的潜力和它们对化学提取性能的影响。为了证实它的

5、回收率 和对超滤渗透液的浓缩能力我们测试了纳滤膜，通过减少溶剂的使用体积从而大幅度的减少了液 体中的离子电荷，增加了化学提取性能。材料和方法：样品预处理：将收集的培养液进行重力条件下的过滤器上过滤袋(10微米的孔隙率)，以去除 聚集的菌丝体的很大一部分。过滤在4C进行，因为青霉素水解在温度高于15 C超敏感(Hersbach 等，1984;。Nabais和卡多佐，1999)。在这一步中青霉素丢失量为在可接受的0.9%。.过滤装置组成：略超滤实验：选择三种不同截留分子量的滤膜 UE-50 (TRISEP, USA, 100,000 Da), HFM-100 (LCI-KOCH, USA, 30,

6、000 Da), HFK-328 (LCI-KOCH, USA, 5000 Da).每一种膜的工作压力分别应用 15，25，80psig 压力测试。这是在工业使用范围内(7-70)。恒压下测试结果显示膜受污染降低了渗透通量。 UE-50，HFM-100的流速固定在0.5m/s, HFK-328为0.65m/s。更高的流速会对膜产生高压，加速 膜的快速污染从而减少膜渗透通量。每种膜的渗透时间从5.0-6.5。原始种子液体积为2-3L.纳滤：纳滤实验采用NF-270膜.压力为200.切向交叉流速度的调整至0.65米/秒。1升预先生成的各 UF渗透物体积为用于这些测试。每个过滤运行进行，直到进料体积

7、浓缩到200毫升，它代表所 述过滤单元的死体积。采样序列和渗透物/浓缩物的表征为所描述的超滤试验相同。参数的计算， 是为了评价每个测试膜的回收率。化学提取过程：为了评估在后续纯化步骤超滤和纳滤的性能，我们使用了传统的乙酸丁酯提取。超滤渗透和纳滤 浓缩，在PH2.0和6N的硫酸酸化，将苄青霉素转移进入青霉酸中，这是一种更加可溶性的形式。（BP的等电点为2.5）100ml体积的液体加入25ml乙酸丁酯，冰浴5min，然后在4C下通过重力作用得到分离相。分 离两个组分。样品分析：样品分析是通过 HPLC。Supelco C18 Nucleosil column （Sigma-Aldrich, 250

8、mmX4.6 mm; 5_m particle size） at40C. The injection volume was 20_L. The mobile phase consisted of 80% （v/v） 0.05MKH2PO4, pH 5.5,and 20% （v/v） acetonitrile （Fisher, HPLC grade）.流速 1ml/min.结果：略讨论：本文研究表明超滤和纳滤结合技术可以有效的分离苄青霉素。好的选择性膜可以有效的提高提取 产量。同时膜过滤可以用于大体积的溶液过滤，它可以用于中试或者工业生产。在此过程中遇到 最主要的问题的就是膜污染现象，其可以通过

9、降低操作压力来减少污染。超滤结果显示，开始时 快速减少渗透流速，然后稳定，缓慢下降直到过滤结束。膜表面会快速堆积可溶解的颗粒物。但 是渗透流速和膜的分子截流量有关。我们比较了两位学者使用不同分子截流量的膜实验结果，8000Da和2000Da流速分别为24.8 and 28.8 L/m2/h，最终的Cf为2.5 .使用5000和30000的膜，得到的流速为19 and 22 L/m2/h，结果Cf4-6 倍高。同时我们使用了145 psig和我们的25 and 80 psig压力比较，将减少能源耗费。过滤装置可 以完全满足保证提取物的生理活性降低水解率。然而使用HKF-328膜则产生很大的丢失和

10、降解。 在分离过程中，温度保持在12度以下，PH保持稳定。我们认为一部分苄青霉素保留在浓缩液中， 而不是被降解。只有85%的产物可以快速通过膜。相比于其他膜有大部分的被截留在膜上。HKF-328的低空隙度可能增加了截留量。超滤渗透的苄青霉素的回收率在可接受范围内，发酵的 液体体积被浓缩10-15倍，然而对于分离而言还不够充分，总体上在分离纯化工程中回收产率则 必须优于90%。为了有效提高回收率，使用透析过滤和超滤结合的方法，Nabais and Cardoso （1999）研究表明透析 过滤加入几体积的蒸馏水可以提高剩余产物的分离。在我们实验中，浓缩发酵液体积10-15倍， 添加一或二透析体积

11、的蒸馏水可以有效提高透析的回收率。（三个膜实验）多余的蒸馏水可以通 过纳滤出去。（下一步）纳滤是非常有效的浓度苄青霉素的技术手段。三次超滤实验可以看出回收率很高可达97-98%。 低百分数的产品丢失和降解表明，纳滤对于浓缩超滤后的苄青霉素是合适的。我们只能浓缩发酵液体积使Cf值达到5,因为使用低的初始体积和系统的死体积。可以预见高的 初始进料体积将会有更好的结果，三个渗透实验在过滤后期渗透通量仍然是有效的。利用反渗透 技术可以得到更好的结果，但这意味着要使用更高的分离压力，相比于纳滤技术。因此，对分离 抗生素而言纳滤是非常可行的方法。同时该技术还可以除去重要的离子电荷（减少渗透压力）， 这一点

12、是不可忽略的。在这一水平级所产生的渗透物可用于渗滤步骤（UF），提高了方法的经 济性通过减少蒸馏水的量，同时增加了全球产量。纳滤膜的污染和分子截留量有关，在我们的实验条件下（恒压），它需要2.5更少的时间纳滤到 5000UF渗透，其特点是低分子量材料，相比于100000超滤渗透物。低分子电荷显著降低浓度极 化和该膜的滤饼层的生产，从而促进更好的渗透通量。事实上，超滤膜的截留分子量不影响苄青 霉素浓缩，但是其在降低污染问题的阶段起着重要作用。化学提取的结果显示超滤可以除去引起形成稳定乳状液的物质。然而，通过30000-100000超滤膜 乳状物质不能完全被消除，可能的解释是在提取过程中苄青霉素的

13、显著降解（大于6%）抗生素 可能进入一种新形式的乳状液中。使用5000的滤膜就可以达到更好的结果。（95%）没有乳化剂时，可以观察到比较低的降解率。相似的报道如Nabais and Cardoso （1999），提取98% 的苄青霉素通过乙酸丁酯使用8000的超滤膜过滤得到的。为了评估提高提取率降低纯化费用，我们只是用纳滤对超滤后的浓缩液进行再浓缩。我们的实验 结果显示，30000-100000膜均不能减少乳化状态，五倍浓缩发酵液观察到高水平的乳化液和降解。 可能的解释是，这也可能解释有两种膜所获得的适度全球产量（YNF）。高溶剂损失作出了贡献 为减轻全球产量。然而，NF可以用5000超滤进行渗透无关于乳液和发展给予高度关注青霉素提 取（92.4%）。该5000分子截留量能消除任何残余乳化剂，使其成为用于分离和纯化的最合适的选择在发酵生产 的苄青霉素过程中。使用这种膜也降低了纳滤过程的结垢问题以及渗透通过程的损失。但是，渗滤步骤必须结合超滤技术同时运用为了增加全球产量（YNF）。NF膜以及结合反渗透 技术具有显著潜力浓缩生物活性分子。HFK-328和NF-270膜的耦