细胞培养基本技术

1、细胞培养基本技术细胞培养的基本概念1细胞培养（cell culture） 从体内组织取出细胞模拟体内生理环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。在细胞培养中，细胞不再形成组织。常用术语及解释 体外培养（in vitro）：原意为在试管中，现常与组织培养一词通用，译为体外培养。组织培养（tissue culture）：维持组织在体外生长，也泛指体外培养。器官培养（organ culture）：在体外维持器官、器官的部分或器官的原基生存和生长的方法。细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培养：

2、使用器官原基或器官的一部分或整个器官贴壁肺上皮细胞原代培养（primary culture）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养，并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 简言之：从体内取出细胞或组织的第一次培养。再培养（subculture）：同传代。传代（passage）：也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。分离一次再培养称为传一代。细胞株和细胞系细胞株：经原代培养的组织细胞，培养到第10代左右，度过第一次死亡危机后的细胞群，这种细胞

3、的遗传物质没有发生改变；细胞系则被定义为可以度过第二次死亡危机，传代培养到4050代的细胞，这部分细胞的遗传物质发生了部分改变并且细胞带有癌变的特点，这种细胞在适宜条件下无限传代。描述任何新的细胞系时，均需祥尽说明该细胞系的特征及培养经过，从其他实验室里取得的细胞系必须维持该细胞系的原名。由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（subline）。 细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。描述一个细胞株时，必须说明它的特殊性质或标志。与细胞系类似，如果不能继续传代或传代代数有限，可称为“有限细胞株（finite cell strain）”。如果可以连续传

4、代，则可称为“连续细胞株（continous cell strain）”。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，可称为亚株（substrain）。克隆（clone）则为细胞株的一种特殊情况，指由一个细胞增殖所形成的群体。 单层培养（monolayer culture）：粘附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层,这种培养方式称为单层培养。 悬浮培养（suspension culture）：细胞在培养液中是悬浮状态生长。贴壁依赖性（anchorage-dependent）为细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。贴壁依赖性细胞（ anchorag dependent cel

5、l ）：细胞（或培养物）只有贴附于不起化学作用的物体（如玻璃或塑料等无活物体）的表面时，才能生长，生存或维持其功能。 无贴壁性（anchorageindependent）：不依赖于贴附底物或支持物上生长的性质。 汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底物面积。 近汇合（sub-confluent）：细胞在底物上生长接近，但尚未完全汇合。超汇合（super confluent）：单层培养细胞附在底物上生长，汇合后发展成多层状态。接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引

6、起抑制增殖的现象。群体密度（population density）：培养底物单位面积上单层细胞数目。饱和密度（saturation density）：在特殊培养条件下，每平方厘米（单层培养）或每毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。体外细胞培养物的生长类型 按生长方式: 2型 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞， 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞 可在悬浮状态下生长 贴壁(粘附)型细胞 粘附: 是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式含义 两方面基于粘附特性，

7、使细胞与细胞之间相互结合形成组织； 有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面， 才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后，同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞。 类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位的 外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 上皮样细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角

8、形，中有圆形核 生长特点 易相连成片 相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动 成纤维细胞样细胞 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起 每代贴壁生长细胞的生长过程游离期贴壁期繁殖期维持期衰退期游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时

9、细胞质回缩，胞体呈圆球形，折光性强。 约持续10分钟一4小时。贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时开始贴壁。24小时后大部分细胞均已贴壁，圆形细胞变成延展状态，细胞立体感强，细胞质颗粒少而透明。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的底物附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。繁殖期（生长期） 此时细胞快速生长和分裂。细胞数目增多，由几个细胞形成细胞岛到形成良好单层。又可分为四级：+：细胞占瓶壁有效面积25%

10、+：细胞占瓶壁有效面积25% 75%+：细胞占瓶壁有效面积75% 95%，但仍有空隙+：细胞占瓶壁95%以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密。+ +为对数生长期。此时细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。维持期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性细胞界限模糊，细胞内颗粒增多，透明度降低，立体感较差。代谢物积累，CO2增多，培养液逐渐变黄。衰退期：细胞内颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。细胞皱缩，细胞质空泡，衰老死亡，从瓶壁上脱落下来。培养细胞生长的条件1. 细胞的营养需要2. 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5

11、% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3. 无污染 4. 无毒 实验准备实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒

12、 超净台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 滤 器 CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气； 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪培 养 板 培养瓶 常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉、洗洁剂）、浸酸（6-24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干清洗后的玻

13、璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质（如铅和砷）等先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干涸后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不

14、掉的微量杂质浸泡时应使器皿完全浸没，且容器内部要充满清洁液，不留气体死腔（即勿留气泡或器皿露出清洁液面）浸泡时间：一般为浸泡过夜，不应少于6 小时清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63 1000 200 次强清洗液 120 200 1000 弱清洁液 100 100 1000配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和耐酸围裙，并要保护好面部及身体裸露部分； 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停地用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择耐酸的陶瓷或塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留

15、污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置，特别是吸管、移液管等如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满后倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用消毒细胞培养的最大危险

16、是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min干烤：160, 2 小时过滤：0.22m化学消毒灭菌法75%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染2 细胞培养用液的配制水：新鲜配置

17、的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 。培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的

18、溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，

19、要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子； 激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清。对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。无血

20、清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，

21、绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 。 血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟血清的消毒：过滤除菌抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成基础培养基 8095血清 5 20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100

22、卑位毫升培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有3种。 1、悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3、贴壁生长细胞传代 采用酶

23、消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：1. 吸光培养瓶中的培养液2 .加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5. 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7. 将后者放入培养箱中培养。无菌操作防止污染是决定培养成功与否的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。无菌室的灭菌实验人员的无菌准备无菌操

24、作的注意事项无菌操作 无菌室的灭菌1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟，关闭灯后启动送风机运转2分钟后再进行培养。4.实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。无菌操作实验人员的无菌准备1.肥皂洗手。2.穿好工作服、带好工作帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦净双手。How to wash your hands1 湿润双手并取肥皂或洗

25、手液涂抹2 手掌对手掌摩擦3手背对手掌摩擦4 两手指缝相对互擦5 双手并扣互擦指背6 拇指在掌心旋转擦洗7 指尖对手掌擦洗8 流水冲净(内科无菌洗手法冲水时双手须低于肘部；外科无菌洗手法，保持双手高于肘部）无菌操作注意事项 1. 凡是带入超净工作台内的如盛酒精、PBS、 培养基、 胰蛋白酶等的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面；2. 靠近酒精灯火焰操作（进行无菌操作时，首先要点燃酒精灯）；3. 器皿使用前必须过火灭菌，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口；4. 继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火；5. 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6. 进

26、行培养操作时，动作要准确敏捷，但不能太快，以防空气流动，增加污染机会；不能用手触及已消毒器皿，如已接触局部，不便消毒时，应取备用品更换（吸管、离心管等备用量是使用量的3倍)； 7. 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染；8. 金属器械不能在火焰中烧的时间过长，以防退火。烧过的金属镊等要待冷却后才能夹取组织，以免造成组织损伤；9. 已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中； 10.工作台面布局：右手使用的物品放置在右 侧，左手使用的物品放置在左侧，酒精灯置于中央； 11.保持顺序性：组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露

27、在空气中；培养用液在未见前，不要过早开瓶，用后如不再重复使用，应立即封闭瓶口；12.培养用瓶开瓶以后，皆应保持45斜位或平放，开口向上长时间直立会增加落菌机会；13.工作中不能面向操作区域讲话或咳嗽，以免把细菌或支原体带入工作台面发生污染。细胞培养常见问题解答培养液pH 值变化太快CO2 张力不对按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5 到10改用不依赖CO2 培养液培养瓶盖拧得太紧松开瓶盖1/4 圈NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度 培养液中盐浓度不正确在CO2

28、 培养环境中改用基于Earles 盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液细菌、酵母或真菌污染丢弃培养物或用抗生素除菌培养液出现沉淀，但pH值不变用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌冰冻保存培养液将培养液加热到37，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液培养液出现沉淀，同时pH 发生变化细菌或真菌污染丢弃培养物抗生素除菌培养细胞不贴壁胰蛋白酶消化过度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度支原体污染分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物培养液中无贴壁因子培养细胞生长减慢 由于更换不同培养液或血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验增加起始培养细胞浓度 培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏让细胞逐渐适应新培养液，换入新鲜配制培养液，补加谷氨酰胺或生长因子。培养物中有少量细菌或真菌污染用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培