细胞重组和克隆技术

1、关于细胞重组与克隆技术第一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞重组(又叫细胞拆合) 是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。定义第二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 从原生动物等低等生物的去精细胞或互换细胞核的细胞，可以清楚看出真核细胞的细胞核与细胞质是相互配套、精确平衡的。 例如，将变形虫切成两个半，一半有核、一半无核；无核的一半虽然仍能消化已经吞噬的食物但不能重新摄取食物、对外界刺激也不再发出反应。 同位素示踪法证明，这无核的一半虽仍能吸收和结合无

2、机磷，但其吸收和结合率均呈直线下降。 在用电镜观察时可发现其细胞内的膜结构如高尔基体、内质网系等会出现退化。 而有核的那一半照样能够摄食，对刺激也有反应，失去的收缩泡可被补偿，还能生长并及时分裂。如果用一显微勾针将变形虫的细胞核钩出，这种变形虫的行为就会变得与无核变形虫一样，如在及时植入同种变形虫的另一个核，上述各种生命活动又会重新恢复。第三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。 如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果； 绿草履虫体内

3、的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。 这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。特点第四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程特点第五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 1、将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。 2、结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物。因此细胞重组技术现巳成为现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一。 3、只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性

4、状相功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要意义。意义第六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体（3）胞质体与核体重组形成重组细胞812 细胞重组技术第七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 胞质体是去除细胞核后由膜包裹的无核细胞。 微细胞又可称为微核体，含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整的质膜的核质体。 胞质体和微细胞与完整细胞融合后就能产生相应的杂合体。 胞质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新型

5、细胞，在适宜条件下能成功的生存下去。第八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 显微操纵术 细胞分离技术细胞破碎方法 细胞器的分离胞质体、核质体和微细胞的制备第九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置显微操作仪，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。8.1.2.1 显微操纵术第十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月8.1.2.1 显微操纵术第十一张，PPT共一百四十二页，创作

6、于2022年6月 用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、测量微电位的变化等等。 意义 1、实现细胞的拆合 2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。第十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括： 细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用8.1.2.2 细胞分离技术第十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 经常采用的细胞分离方法如下：（一）差速离心（differ

7、entialcentrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。第十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 第十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 经常采用的细胞分离方法如下：

8、（二）梯度沉降分离法 主要是根据细胞大小不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过密度介质、或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。 常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液这此介质主要有：血清、蔗糖等：第十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 （三）等密度沉降分离法 主要是根据细胞密度差异来分离细胞。 细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。 如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。 目前常采用的分离介质有蛋白等。密度

9、分离剂应该具有无刺激，对细胞无吸附作用，产生的渗透压小等特点第十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (四)流式细胞仪分离法 这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50um的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以l0m/s的速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲通过测定脉冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的细胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同的各种细胞

10、。 这种方法的优点是分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能；缺点是需要专门的设备。第十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法包括(一)超声波破碎法 原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。 缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。8.1.2.3 细胞破碎方法第十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月第二十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月第二十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 （二）反复冻融法 使细胞溶液

11、或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内冻结后，在37复温融化，重复3-4次操作使细胞壁破碎。 (三)化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎；由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞裂解后应注意清除化学裂解剂。第二十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (四)高速组织捣碎法 主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。 由于也会发热，可能导致分离物的降解，因此不能时间过长必要时可使用循环水冷却第二十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生

12、理功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。 常用的方法有：研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用以上介绍的沉降分离法实现分级分离。8.1.2.4 细胞器的分离第二十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月实验 细胞器分离、制备与观察【目的】1掌握分离制备动物细胞线粒体的方法。2对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。第二十五张，PPT共一百四十二页，创

13、作于2022年6月 将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。 细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。第二十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结

14、构和酶的活性； pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。 整个操作过程样品要保持在04，避免酶失活。第二十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。第二十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月鼠肝线粒体的分离【材料】鼠肝脏或猪肝脏。【实验用品】1试剂：(1) 0.25 molL蔗糖+0.01 molL三羟甲基氨基甲烷(Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)： 0.1 mo

15、lL三羟甲基氨基甲烷溶液 10 mL 0.1 molL盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 molL。(2) 0.34 molL蔗糖+0.01 molL Tris一盐酸缓冲液(pH7.4)，配法同上。第二十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月1詹纳斯绿B(Janus green B)染液 姬姆萨染液(Giemsa)：2器具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。第三十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月【实验步骤】1制备肝细胞匀浆： 实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，

16、用滤纸吸干水，称取肝组织2g，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 molL蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。第三十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月2差速离心： 将0.34 molL蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。 用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。第三十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月分离细胞核： 沉淀(细胞核及质膜碎片)鼠肝匀浆1500r/min,离心10 min 上清液(1)洗涤(0.25 m

17、olL预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次，每次1500r/min离心15 min。沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(2)与上清(1)合并第三十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月分离细胞核： 沉淀(线粒体)混合上清液10000r/min离心10 min上清液(弃去)洗涤,加预冷的0.25 molL蔗糖溶液10 mL，10000r/min离心10 min沉淀(纯化的线粒体) 上清液(弃去)第三十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月活性鉴定： (1) 细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸3:1）15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸

18、馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40)检查，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。(2) 线粒体： 取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加1詹钠斯绿溶液染液，10 min后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。第三十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 这三种是细胞重组常用的几个原料，因此在此重点介绍(一)胞质体 方法 细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核，结合高速离心得到了胞质体。 影响制取胞质体的因素： 容器，有玻璃片、塑料片、离心管、培养皿、培养瓶等，需在灭菌恒温培养室中进行。 适宜的温度、细胞松弛素B的剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、细胞密度

19、等。8.1.2.5 胞质体、核体和微细胞的制备第三十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 特点： 植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。线粒体的运动十分活跃，线粒体膜上各酶系的分布及氧化磷酸化过程都照样存在。 胞质体内线粒体内自主性的DNA复制尚能有限地进行着。 蛋白质的合成在去核后的一段时间内持续进行。 因此，去核细胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品。第三十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 （二）核体 与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。

20、 核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 为了生产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞和胞质体。 可在去核处理后,从离心管底部收集样品,接种于培养皿内,温育1-2h，由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复1-2次,可使核体的纯度高达99。第三十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (三)微细胞 秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。 经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含有

21、一个或数个染色体的DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材料。第三十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新组合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们更新装配成新的活细胞。第四十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月821 克隆的定义 “克隆”“来源于希腊语。原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体 克隆是指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖。82 克

22、隆技术第四十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 8.2.2 克隆的相关理论基础 克隆在植物界已有上千年的历史。但理论的上的突破则是发生在20世纪。 1902年德国植物学家哈伯兰德提出，植物的体细胞具有母体全部的遗体信息，具有发育成为完整个体的潜能。因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。第四十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 虽然，从理论上讲，任何一个细胞都含有其生物体系基因组的全部基因，因此都可以被克隆。但实际上，动植物细胞克隆结果差别很大。克隆现象在植物界普遍存在。既可以是自然的。也可以是人工的。第四十三张，PP

23、T共一百四十二页，创作于2022年6月 与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不再产生完整的充分分化的个体，然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性或基因组连续性、一直是发育生物学要解决的问题 第四十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 早在20世纪30年代，著名的胚胎学家斯佩尔曼就已经提出了分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体。也就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认知、人们采用胚胎分割及胚胎

24、细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。第四十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 这种对动物细胞全能性的认识自1997年后得到改变，体细胞克隆动物“多利”羊的成功证明成熟的体细胞也具有全能性；后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分证明高度分化的细胞核仍具有全能性。 因此，人们对细胞全能性有了全新的认识。第四十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 目前，克隆技术最成功的应用体现在克隆动物的培育上。 下面将重点介绍的克隆主要是指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技术：8.2.3 克隆的技术方法第四十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (一)定义 细胞核移

25、植技术 是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术。8.2.3.1 细胞核移植第四十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 由于主要的遗传物质存在于细胞核中，因此，核移植的受体将具有与核移植供体完全相同的遗传基础，因此，细胞核移植技术在动物育种工作中具有十分重要的意义。 因为它像植物中的组织培养那样，可以利用一头优质的动物(例如高产的奶牛)复制出与它生得完全一样的成千上万的细胞核移植系动物。 细胞核移植技术是克隆技术的关键。第四十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞核移植所得到的杂种称为核质杂种。 根据细胞核移植对象的不同可分

26、为胚胎细胞核移植、体细胞核移植等。 开始时，进行细胞核移植主要是为了研究胚胎发育进程中细胞核和细胞质功能及两者之间的关系，探索有关遗传、发育和细胞分化等方面的理论问题。后来发现，这项技术可以实现不同细胞核和细胞质的组配，从而培育出新物种。第五十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (二)发展历史 1、提出思想 第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是诺贝尔奖获得者德国胚胎学家汉斯施佩曼博士， 他构想了一个“奇异的实验”：把一个卵细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的细胞核放入这个卵细胞中。 但由于技术等方面的原因使他没能找到将细胞核导入卵细胞的方法。第五十一张，PPT共

27、一百四十二页，创作于2022年6月 2、建立技术及低等动物试验 1952年，美国人罗伯特.布里格斯和TJ金首先利用两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术。第五十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月3、高等动物试验 经过大量低等动物实验成功之后，研究人员开始进行哺乳动物的移核试验。最早用来作移核试验的哺乳动物是小鼠。 1977年，美国的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有母体一方的染色体，故称之为单亲小鼠。第五十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 随着技术手段的发展和进步，哺乳动物的细胞核移核实验开始进入一个令人嘱目的新阶段。 1

28、981年，瑞士日内瓦大学的卡尔伊尔门泽和美国杰克逊实验室的必得霍普首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育到囊胚期、再将此胚胎植入同步孕小鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。第五十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 我国的细胞核移植技术工作开始于20世纪50年代，主要是在两栖类和鱼类上进行的。 1961年开始，童第周等以金鱼和鳑被鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及细胞质对细胞核的影响。我国的细胞核移植研究第五十五张，PPT共一百四十二页，

29、创作于2022年6月 1980年4月，中国科学院武汉水生生物研究所利用鲫鱼做移核试验，成功地培育出两尾无性繁殖的幼鱼。 之后的1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种，这个新品种的“鲤鲫核鱼”既具有鲫鱼的鲜美味道，又具有鲤鱼的生长快速。第五十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 2008年，鲤鲫移核鱼是采用无性杂交的细胞工程技术，将荷包红鲤的囊胚细胞核移植到鲫鱼的去核卵中而发育形成的后代。 其鱼体呈红色，外形特征与鲤鱼相似，但也同时具有一些鲫鱼的特征，具有比较稳定的遗传性状。F1F4代（14子

30、代），基本性状趋于一致。其生长速度明显快于鲫鱼，并且比荷包红鲤快35左右。 用鲤鲫移核鱼F2雄性与镜鲤杂交而获得的杂交一代被称为颖鲤。颖鲤具有明显的生长优势，其生长速度比 双亲快42左右。第五十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 镜鲤( 德国)第五十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞核移植技术的建立，为今天的哺乳动物体细胞克隆打下良好的实验基础。哺乳类细胞核移植技术的发展和成功，经历的是一个艰难曲折的过程。 哺乳类卵细胞的体积很小，因此哺乳类的移核实验必须采用显微操作技术，从而对细胞进行细微手术，如：细胞核移植、基因注入以及单个细胞的分离。8232 核移植技术

31、第五十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 这种装置可以在机械或电子的控制下人工操纵 也可以把程序输入微机，自动进行抓、切、挤压、注入、缩回等动作。 也可用激光做切割工具 显微操作技术的发展对研究细胞核质关系、基因工程、克隆技术的作用越来越大。8232 核移植技术第六十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 细胞核移植必须有一个前提，就是要尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期，高等细胞发展到一定阶段时都要进行有丝分裂，而各种细胞的有丝分裂周期是各不相同的。 在哺乳动物核移植实验中的核供体细胞和核受体细胞可能处在细胞周期的不同阶段上。现在可以通过采用“饥饿技术”来减慢细

32、胞活动、迫使供体细胞处于某种休眠状态，以期获得与受体细胞同步的状态，便于两者的结合。第六十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 我国在细胞核移植技术选育鱼类新品种方面处于世界领先地位，以鱼类细胞核移植为例，详细介绍一下细胞核移植技术要点： (一)供体和受体的准备 供体通常为鱼类的囊胚细胞或成体细胞。 受体为成熟的卵细胞。该受体卵一般可通过人工催产的方法得到。卵子在接受供体核之前要先激活来获得发育能力。 对于鱼卵而言，当它被挤入水中即可被激活。对于两栖类动物的卵可采用针刺方法。最关键的是供体和受体在发育时间上要配合好，保证在受体成熟卵刚产出时,供体受精卵发育至囊胚期。第六十二张，PP

33、T共一百四十二页，创作于2022年6月 (二)去卵膜和卵核 可用小镊子在解剖显微镜下仔细剥去卵膜，或用适当的胰蛋白酶溶液软化卵膜，经过轻轻晃动，使卵子从中脱出。 鱼卵-极细的玻璃微针借助第二极体标志(卵核位于极体下方)挑出细胞核。 两栖类-紫外线照射受体卵达到去核目的。第六十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (三)供体细胞制备 将发育至囊胚期的胚胎或组织器官进行机械切割，置于胰蛋白酶溶液中处理几分钟，直至分离出单个细胞。 也可将囊胚细胞或得到的离体细胞短期培养后用作供体。第六十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (四)移核 由于细胞核极小，而且脆弱，因此需要极其小

34、心，防止损伤细胞核或伤害到细胞质。 实际上核移植时，核周围的少量细胞质也一起注射进了去核后的受体细胞中了。30-40min中内完成，温度：16-18第六十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞、体细胞等。 其中以胚胎细胞克隆的应用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。8.2.3.3 克隆动物一般制备技术第六十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月移植细胞核的来源不同分为 胚胎细胞核移植法 胚胎干细胞核移植 胎儿成纤维细胞核移植 体细胞克隆技术第六十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 （一）胚胎

35、细胞核移植法 将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合。发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。第六十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 原则上，一枚早期胚胎有多少个细胞，通过这种方法就可以克隆出多少个个体。还可将细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多克隆动物。 图8-2显示的是对胚胎细胞进行核移植克隆出动物的具体过程，由图8-2可以总结出图8-3所示的克隆动物培育的一般过程。第六十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 第七十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 1984年，英国科学家施特恩维拉德申在仙台病毒或电激

36、诱导下，成功地克隆了一只小绵羊，从此为家畜哺乳动物的克隆工作开启了先河。 目前经此法克隆出的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、猴等。第七十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 日本通过移植牛受精卵细胞核的方法于1945年克隆了两头雄性“孪生牛”。1990年以来，日本国内已经成功克隆了150多头牛。 1998年9月新闻报道，日本已有大量克隆肉食牛上市。第七十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 中国科学院发育生物所于1990年最早进行兔细胞核移植实验。我国的哺乳动物细胞核移植实验，首先在山羊的克隆上获得成功。 1990年，西北农业大学利用细胞核移植的方法得到了克隆山羊。

37、 1992年，江苏省农业科学研究院核移植兔成功。 1995年，中国科学院发育所与杨州大学合作，利用细胞连续核移植的方法克隆山羊成功。1995年，广州华南师范大学激光生命科学所和广西农业大学动物繁殖研究室合作，成功地克隆了一头黑白花牛和黄牛的杂种牛。第七十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 1995年10月，西北农业大学畜牧所采用胚胎细胞核移植技术，克隆了6只小猪。 1996年12月，克隆小鼠在湖南医科大学诞生。 哺乳动物的胚胎细胞在分裂成8细胞以前，所有的单卵裂球均为全能细胞，即每个卵裂球均能表达此个体的全部基因。理论上这时的每个卵裂球经过核移植，都能发育成遗传性状完全相同的个体

38、。 这些工作为进一步研究细胞核和细胞质的相互关系建立了很好的模型。第七十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月（二）胚胎干细胞核移植 将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分代培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。 再利用细胞核移植技术，可以比胚胎核移植生产出更多的动物个体。 但目前仅有小鼠分离克隆出其胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。第七十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 新华社伦敦2009年月日电（记者黄堃）英国科研人员日报告说，他们利用胚胎干细胞首次成功制造出人类精子，但科研人员表示不会

39、将这种试管精子用于人工授精。英国纽卡斯尔大学日发表新闻公报说，该校和东北英格兰干细胞研究所等机构的科研人员利用一种含有视黄酸等物质的培养介质，对含有和两种染色体的男性胚胎干细胞进行培养，并促使其实现完全的减数分裂，最终培养出含有23条染色体的试管精子。研究人员卡里姆纳耶尼亚说，这项研究有助于深入分析男性不育的原因，并用相关知识帮助那些希望有孩子的不育夫妇。例如，由于采用化疗方法，被治愈的白血病男性患儿成年后可能不育，这项研究便可帮助分析其中的原因。研究人员同时表示，他们不会利用试管精子进行人工授精，这不仅是因为英国法律不允许，且从科学角度讲，这样做对研究小组也没有意义。第七十六张，PPT共一百

40、四十二页，创作于2022年6月生物学家卡里姆调制出一种化学物质和维生素构成的“鸡尾酒”，在这种“鸡尾酒”培养环境下，人体干细胞转变成精子。第七十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月（三）胎儿成纤维细胞核移植 从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。 1996年，英国报道利用此法克隆出3只山羊。第七十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。8.2.3.4 体细胞克隆技术第七十

41、九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 早在20世纪50年代就有利用体细胞克隆成体蛙的先例，其后的科学家们几十年来一直在利用体细胞期望克隆出哺乳动物个体、但均未成功。1997年2月23日英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司的胚胎学家伊恩维尔穆特博士的研究小组经过多年的无性繁殖实验无性繁殖了一只雌性小绵羊“多莉”(见图84)。维尔穆特解释他的多莉是“有史以来第一次通过成熟细胞的核移植生产出来的动物后代” 多莉与以往的克隆动物的最大区别是它的核供体是高度分化了的体细胞乳腺上皮细胞，而不是尚保留细胞全能性的早期胚胎细胞。这是克隆技术领域的一项重大突破，利用这一技术可以大批复制某一动物。

42、第八十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月第八十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月多莉培育者之一伊斯维姆.穆特第八十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 以克隆羊多莉的制备过程为例详细介绍一下体细胞克隆动物的技术。(1)供体的选择 芬兰多塞特白品种绵羊的乳腺细胞 取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊 (芬兰多塞特白品种绵羊)的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”使具进入休眠状态而使全部基因具有活性。第八十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月(2) 受体的选择 苏格兰黑面母绵羊卵细胞 注射促性腺激素GN促使母羊排卵，28-33h取其未受精卵快速去核，放

43、入10%FCS(小牛血清)、1FCS和0.5FCS连续5天，饥饿使其进入G0期作为受体细胞。第八十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月(3)乳腺细胞注射GN 34-36h后与无核卵放入同一培养皿中。在微电流作用下乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新遗传物质的卵细胞。第八十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 (4)将新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内、6天后发育成桑椹期胚胎或囊胚(8-16个细胞)，再移入假孕母羊子宫内。 (5)产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。第八十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月第八十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月

44、能使异种动物借腹妊娠、产仔，加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物(如大熊猫)； 建立重要疾病的基因模型，生产生物活性药物。 为了解细胞发育的潜能性、细胞核和细胞质之间相互关系、胚胎发生死亡及其调控研究提供了新视角，因此对揭示生命科学重大基础理论问题具有重要的科学价值。 824 克隆技术的应用与意义第八十八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。尽管目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用的前景。824 克隆技术的应用与意义第八十九张，PPT共一百四十二页，创作于202

45、2年6月 在多莉羊诞生之前，普遍认为低等生物和高等植物的细胞具有全能性，而高等动物的体细胞没有全能性。 目前克隆技术取得的结果，为再生、修复、治疗组织器官缺损等奠定了理论基础，也增加了采用高度分化的体细胞克隆各种动物的信心。8.2.4.1 检验动物细胞全能性第九十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 8242 加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物 由于体细胞数量巨大和易于获得，因此动物克隆技术有助于加速动物育种的进程。 利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。（大熊猫交配的季节在春季三至

46、五月份，通常不超过24天。 ）第九十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 也可以结合基因工程技术将具有特殊功能的基因(如具有一些经济性状、抗虫、抗病等)导入体细胞，然后用克隆技术培育出人们希望的动物新品种。 200l年4月，一种具有极高科学价值的商品利用克隆技术培育的金鱼由美国一家基因复制公司投放市场，这标志着克隆动物已经开始了商业化历程。第九十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月克隆濒危物种 2002年4月27日,中国农业大学成功克隆了第一头优质中国黄牛,这标志着中国在动物体细胞克隆领域取得了重要进展。这头名为“波娃”的体细胞克隆中国黄牛所使用的核供体细胞来源于一头不

47、足六个月的冀南牛纯种小母牛的耳朵皮肤组织,而使用的卵母细胞取自于屠宰场宰杀后的母牛卵巢。“波娃”与其供体细胞的遗传物质完全相同,而与其代孕母亲荷斯坦奶牛在遗传上分属不同来源。该次克隆成功属国际首次,此次克隆中国优质黄牛的成功使目前挽救濒临灭绝的优良黄牛品种成为可能。第九十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月西门塔尔牛外貌特征:黄白花或淡红白花头生产性能:西门塔尔牛肉、乳用夏洛莱牛 外貌特征: 被毛为白色或乳白色生产性能: 长势快，瘦肉产量高 利木赞牛外貌特征: 毛色为红色或黄色生产性能: 产肉高，肉质量好 鲁西黄牛外貌特征:个体大，产肉率高生产性能:繁殖率高，肉质好第九十四张，PP

48、T共一百四十二页，创作于2022年6月 动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。第九十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月克隆宠物 2004年8月6日美联社报道:美国加州“遗传储存与克隆”公司近日正式宣布,他们成功地培育出了世界上首对克隆宠物猫,今后,他们将在世界范围内推广宠物克隆业务,需要交纳5万美元的“克隆费”,你家的宠物就可以有个一模一样的伙伴了。第九十六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 由于克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良

49、好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。 利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。 用这种方法培育出的组织不会产生免疫排斥反应8243 医药领域具有与患者正常组织完全相同的基因构成第九十七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，科学家已开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞 。 移植器官来源不足是各国存在的普遍问题，所以人们开始致力于异种器官移植和克隆器官移植的研究。 人们可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。8243 医药领域第九十八张，PPT共一

50、百四十二页，创作于2022年6月 目前我国的年器官移植数量已经位居世界第二，其种类和成功率也都达到或接近国际先进水平。 但还存在着基础研究薄弱、研究体系分散和社会捐献活体器官意识不强、数量较低以及相应立法不完备等问题。第九十九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 未来人类器官移植治疗将集中在人对人的同体器官移植、动物对人的异体器官移植和克隆人体器官移植等方面。 其中克隆人体器官更具有光明的前景，将解决一系列移植方面的关键问题，不过目前其实际运用还为时过早，因为虽然现在可以复制具有机械功能的脏器，但如何还原其生化作用还有待于探索。第一百张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 目

51、前，我国科学家已成功复制了羊颅骨、鸡肌腱和猪关节软骨等组织，这意味着我国复制人体组织器官研究已进入了一个新阶段。第一百零一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 8251 技术尚不成熟 现阶段克隆动物等技术尚不成熟，还处于探索阶段。目前所得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。 例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出277个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。 此外，克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。8.2.5 正确看待克隆技术第一百零二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 8252 克隆动物的体细胞突变

52、、寿命及其他遗传问题 基因突变与DNA复制次数紧密相关。分裂越多的体细胞发生突变的可能性就越大，这与通过克隆迅速获得大量动物个体的目的相矛盾，是克隆动物材料来源不可避免的问题。 同时，由于克隆是无性繁殖，克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。第一百零三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 此外，出于体细胞分裂代数是有限的，因此克隆动物的寿命是否会受到体细胞分裂代数的影响，也尚不清楚。 2002年1月， “多莉”被诊断患有严重的关节炎，这是科学家对克隆生命的前景表示出担扰。 绵羊的平均寿命为为13年，多莉5岁半就患关节炎显然过早。 在多莉诞生后的3年多时间内，已

53、获得了许多成活的体细胞克隆动物。但是，在大多数研究中，都出现了高频率的出生体重增加，以及胎儿或新生儿的死亡。因此、就目前的研究来看，动物克隆技术要实现产业化是非常困难的。第一百零四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 8.2.5.3 是否是完全的“复制” 就遗传的角度而言。克隆动物的性状可能与其来源的亲本完全相同，但是至少以下一些因素会影响克隆动物的遗传性状： (1)细胞突变 (2)受体卵细胞的细胞膜和细胞质差异 (3)受体遗传上或生理上的差异 (4)后期生长的环境与驯化第一百零五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 大多数人认为，克隆是复制的同义词，复制品与原件是完全一样

54、的。DNA的复制结果就是如此，所以复制用于DNA的合成是一个非常确切的术语。 克隆则是一个过程，克隆产生的个体还需进行胚胎发育和胎后发育，克隆个体与原件之间有一段年龄差异。由于发育过程既受基因主宰又受环境调控，而克隆与其原本尽管基因相同，所处环境却绝不会相同，所以，克隆与其原本不可能像复制品与原件那样完全一样的。第一百零六张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 再者，虽然克隆个体是由核移植产生的，但由于重建细胞的细胞质并非来自原本，而我们知道细胞质中也有遗传物质，它们必然会对个体产生影响，所以不能把克隆个体看成是原本的复制品。 尽管从遗传结构上看克隆个体和原本是姐妹(兄弟)关系，但从年

55、龄上看它们却是亲子关系。无性繁殖的生物仍然有”代”的概念，克隆个体也应有”代”的概念。 而且，克隆个体和原本是可以同时存在。因此，准确地说，克隆个体可以看成是原本的再生，但不是原本的复活。第一百零七张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 有性生殖是生物在长期进化过程中的自我选择、适应环境的结果，是一种有利于种族繁衍和生存的生殖方式。 从这个角度来讲，用克隆动物繁殖生物可能给生物的生存和自然界带来意想不到的后果，同时，最关键的是，这种繁殖方式会造成基因的丢失，不利于遗传物质和生物多样性的保护。于是，有学者认为，克隆动物是违反生物进化规律的，是一种倒退。8.2.5.4 克隆动物的可应用型的

56、思考第一百零八张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 总之，克隆技术的低效率以及克隆动物后代出现的体重增加、体弱多病等事实，使得单独的克隆技术在近期内难以得到推广应用。 可见，在当前世界上的克隆技术还不成熟的今天，人类要克隆出健康的动物仍是相当困难的，也就是说克隆技术在实践中真正应用还有相当长的路要走。8.2.5.4 克隆动物的可应用型的思考第一百零九张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月克隆人的研究进程 、克隆人制备过程 将普通的男性细胞或者是体细胞和一枚女性卵子结合起来，储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名男性的全部遗传信息，最后将胚胎

57、移植到女性子宫中，获得男性克隆后代。 当然，如果一对夫妇愿意的话，也可以克隆女性。8.2.5.5 社会学和伦理学问题第一百一十张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 2002年12月27日,46岁的法国“女科学家”布里吉特布瓦瑟利耶宣布,“世界上第一个克隆婴儿已经降生”。美国麻省理工学院的生物学家鲁道夫居内什对克隆婴儿的真实性表示怀疑。他说:“克隆羊多莉是在277次实验后才成功的,而布瓦瑟利耶说她进行了10次克隆人实验就有5次受孕成功,令人怀疑。”2003年1月5日,布里吉特布瓦瑟利耶又透露第二名克隆婴儿在荷兰诞生。第一百一十一张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 克隆是将一

58、个体细胞的DNA移入一个已经被去掉细胞核的卵细胞中，然后用电激或者化学方法刺激这个改造后的卵细胞，使它开始分裂并成为一个胚胎，这个胚胎的基因是与体细胞提供者的基因完全一样的。 因此克隆人类便会产生伦理道德方面的问题。第一百一十二张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月 一个例子人+动物 中山医科大学陈系古教授等于2001年1月以来，先后使用“核移植”技术，将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过多次实验，成功克隆出多个人类胚胎，其中部分发育到“桑葚胚”阶段。这是国际上首次用该技术克隆出人类胚胎。 但有些学者就对在家兔卵母细胞中克隆出人类胚胎的提出质疑，认为这是违背人类伦理的“科学”实验

59、。第一百一十三张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月第59届联合国大会3月8日以84票赞成、34票反对、37票弃权的表决结果，批准了联大法律委员会上月通过的联合国关于人的克隆宣言，宣言要求各国考虑禁止各种形式的克隆人。 中国、英国、比利时等国在表决中投了反对票。投反对票国家的代表在表决后纷纷发言，强调他们的国家将不受上述宣言约束，将继续允许治疗性克隆研究。第一百一十四张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月国家科技部863生物工程中心主任王洪广接受记者采访时解释说，中国反对宣言的原因并不是赞同“克隆人”，而是因为这项宣言措辞太模糊。 中国认为应禁止生殖性克隆即克隆人试验，不禁止以

60、治病救人为目的的治疗性克隆研究。 “我们对克隆人一贯的态度是四不原则：不支持、不赞同、不承认、不接受。”第一百一十五张，PPT共一百四十二页，创作于2022年6月原因一：治疗性克隆太重要反对一切克隆就像“把孩子和脏水一起泼掉” 为什么我们要坚持不能禁止治疗性克隆，就是因为它对人类的健康、生命太重要了。用比较通俗的说法，把克隆后的干细胞或是受精卵放入母亲的子宫，孕育一个新生命，创造出一个“克隆人”，就是生殖性克隆；而利用克隆技术对干细胞进行“复制、改造”，以用于重建人类的组织、器官进行移植，从而达到治疗疾病的目的，即是治疗性克隆。是以14天为界限严格区分两者的，“胚胎干细胞发育到14天以后，再取