仿制药杂质检查方法建立和方法学研究与评价

1、仿制药杂质检查方法建立和方法学研究与评价主讲人：许真玉讲习组成员：霍秀敏、高杨药品审评中心2008年7月一、概述二、杂质检查方法的建立三、杂质检查方法学验证的要求四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析五、几个小问题的计论六、小结主要内容2杂质：任何影响药物纯度的物质统称为杂质。 药品中的杂质按其理化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。 有关物质：有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故通常又可称之为有关物质。 有关物质包括已知杂质和未知杂质。 主要内容31、杂质检查方法和方法学验证

2、对仿制药的重要意义（1）安全性的重要保证-关注毒性杂质（2）评价仿制药质量是否一致的关健指标之一-仿制药与被仿制药的质量一致-杂质的种类和数量不高于被仿制药（3）杂质研究的基础-杂质检查方法不合适或方法学验证不完善，杂质检查不可靠，无法准确评价药品质量一、概述4仿制药与被仿制药一致性要求药学方面一致（含量、结构、杂质、其它检查项等）杂质的数量和种类低于被仿制药，否则需要分析杂质的安全性并提供有关数据，必要时应进行相关的安全性试验建立杂质适宜的杂质检查方法用于判断一致性用于工艺优化、去除杂质、考察稳定性、控制药物质量一、概述52、目前国内仿制药研究中杂质检查面临的困难-杂质来源不清被仿制药和仿制

3、药杂质的种类和数量不清，包括杂质产生或引入过程、降解途径-杂质检查方法缺乏针对性不知控制何种杂质以及为何控制，缺乏安全性数据的支持-杂质对照品制备困难（受限于工艺困难），方法验证不充分-杂质检查结果难于评价研究基础薄弱，需要提高杂质研究水平，包括杂质检查方法和验证水平，以提高仿制药研制水平一、概述6例盐酸曲美他嗪片进口标准釆用梯度洗脱，对3种已知杂质、单个未知杂质及总杂质分别进行控制国内仿制釆用等度洗脱，仅对未知杂质（单个杂质和/或总杂质）进行控制国内同品种标准对有关物质的规定：总杂质不得过1.0%。一、概述7例BP收载的核黄素磷酸钠杂质检验-HPLC法-已知杂质核黄素：对照品法-其它杂质：相

4、对保留时间加上自身对照的方法5-单磷酸核黄素的保留时间为20分钟3，4-二磷酸核黄素大约0.23，5-二磷酸核黄素大约0.34，5-二磷酸核黄素大约0.53-单磷酸核黄素大约0.74-单磷酸核黄素大约0.9核黄素大约2-4-单单磷酸核黄素峰与5-单磷酸核黄素峰的分离度应不小于1.5一、概述83、本讲所依托的主要技术指导原则和技术要求化学药物杂质研究的技术指导原则已有国家标准化学药品研究技术指导原则 过渡期品种集中审评（化学药品）技术要求 FDA、ICH的相关指导原则-Guidance for Industry,ANDAs:Impurities in Drug Substances,Chemis

5、try,Manufacturing,and Controls Information-ANDAs:Impurities in Drug Products-Q3A(R)-Q3B(R)一、概述94、本讲杂质的范围有机杂质-包括工艺中引入的杂质和降解产物，化学结构与活性成分的分子式类似或具渊源关系，通常称为有关物质无机杂质-产生的无机物残留溶剂-生产过程中使用的有机溶剂来源-工艺杂质、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质（外源性杂质）等结构杂质-几何异构体、光学异构体、聚合物、其它甾体、其它氨基酸一、概述10目的-1、建立杂质检查方法是质控的要求包括具体的分析操作方法，以及计算方法，限度要求-2、用

6、于分析杂质谱考察与被仿制药一致性，进而优化制备工艺及稳定性考察二、杂质检查方法的建立11二、杂质检查方法的建立121、杂质检查方法建立的前提-（1）被仿制药杂质谱如何？参考公开信息：质量标准、说明书、有关文献和专利-（2）自身杂质谱如何？理论综合分析、直接测试二、杂质检查方法的建立13英国药典头孢克洛中收载的杂质谱二、杂质检查方法的建立14杂质谱分析的一些方法（供参考）-分析起始原料中可能存在的杂质例：盐酸曲美他嗪的合成中哌嗪的控制二、杂质检查方法的建立15-分析中间体杂质-分析副反应及副反应产物制剂工艺中可能的Millard反应杂质产生的来源？结构？工艺条件（灭菌温度、灭菌时间）的影响？例：

7、氨甲环酸与葡萄糖二、杂质检查方法的建立16-推测降解产物举例：甘氨酰谷酰胺 降解杂质：环-（甘氨酰-谷氨酰胺）和焦谷氨酸二、杂质检查方法的建立17研究头孢菌素的降解途径研究，为杂质谱提供基础二、杂质检查方法的建立18-UV法（HPLC-PAD）二、杂质检查方法的建立19-LC-MS/GC-MS或CE-MS法-HPLC峰保留时间对比法 用于未知杂质或未定性杂质的“标记”-其他方法杂质研究实例.DOC二、杂质检查方法的建立202、仿制药杂质检查方法建立的一般考虑点（1）参考被仿制药的方法被仿制药杂质检查方法和限度如何？标准中控制了哪些杂质？重要参考，为方法建立提供重要的信息，全面考察不可简单套-工

8、艺或处方的不同，二者的杂质谱可能不同，被仿制药杂质检查方法可能不适用-被仿制药标闪较低，无杂质检查项或控制较为简单-被仿制药的杂质检查方法无法获得二、杂质检查方法的建立21（2）结合杂质理化特点根据杂质谱，考虑杂质结构、理化性质例如：阿司匹林 比色法游离水杨酸（CP2005）葡萄糖UV法5-羟甲基糠醛（CP2005）氨基酸原料药 TLC法其他氨基酸（CP2005） 二、杂质检查方法的建立22（3）结合杂质的毒性特点安全性控制的需要被仿制药和自身杂质的毒性如何？重视药理毒理及临床安全性研究的结果的作用对于有些分子通过以下化学反应可能产生潜在的遗传毒性作用-烷基化-交联-脱嘌呤可参考遗传毒性结构库

9、遗传毒性杂质或具有可能引起遗传毒性的结构（alerting stucture）的杂质需要建立灵敏的试验方法-EMEA遗传毒性杂质限度指导原则：毒理学阈值（TTC）1.5ug/人/日二、杂质检查方法的建立23(4)考虑不同检查方法的特点主要是灵敏度和专属性能否符合要求痕量杂质和遗传毒性杂质的严格控制，对方法的要求较高-化学法vsTLC法vsHPLC法-HPLC/MS，HPLC/荧光CE法可用于微量样品GC适用于挥发性杂质检查二、杂质检查方法的建立24（5）注意多种方法联用由杂质多样性复杂性和方法局限性所决定单一方法不能满足多个杂质的检测时，可釆用两种或两种以上的方法互为补充，控制杂质-化学法、色

10、谱法、光谱法、生物检定法-同一方法釆用不同的测试条件如正相HPLC、反相HPLC、不同流动相的反相HPLC等-分离技术与检测手段联用，较为有效，如HPLC、GC、LC-MS、HPLC-PDA、CE等例：肝素钠中多硫酸软骨素的NMR检查方法二、杂质检查方法的建立25（6）综合药学其他研究结果杂质检查与药物外观色泽、含量等项目间存在密切联系，如果这些项目发生明显变化，而杂质基本不变时，应分析原因，关注杂质检查方法的可行性二、杂质检查方法的建立26例：5-羟甲基糠醛的检查方法的综合分析-溶液颜色法、紫外法、HPLC法葡萄糖注射液颜色深浅与5-HMF产生的量有关，非葡萄糖注射液变色唯一因素，专属性、准

11、确性差5-HMF的最大吸收波长为284nm，干扰较少如果制剂中的主药或辅料在284nm有明显的明收，会干扰5-HMF的检查，可釆用HPLC法代替二、杂质检查方法的建立273、杂质检查常见方法介绍HPLC法-考虑被仿制药的色谱条件-参考同类物质质量标准中的杂质检查方法-一般选择多种色谱条件 反相和正相-方法包括固定相、流动相、洗脱方式、波长、测试样品的处理、具体操作、计算方法二、杂质检查方法的建立28（1）固定相的选择-根据待研究的药物的特性选择合适填料的柱子，常用RP-HPLC，色谱柱多选用C18柱，C8柱、苯基柱、氨基柱也有使用-C18柱时，流动相有机溶剂%通常5%-流动相PH值2-8PH8

12、，溶解硅胶载体，宜选用耐碱填充剂：包覆聚合物、高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、非硅胶或有机-无机杂化填充剂-PH2，键合相水解脱落，宜选用耐酸填充剂：有机-无机杂质填充剂、具有大体积侧链的二异丙基或二异丁基取代基取代C18键合硅胶等二、杂质检查方法的建立29注意不同品牌柱子在耐用性方面的研究：-当杂质峰与主峰的分离情况不十分完美-确定辅料峰的相对保留时间（用于定位扣除辅料峰的干扰）-确定特定杂质的相对保留时间-确定有关物质出峰完毕的保留时间 当不同品牌而引起以上各因素不固定时，应在标准中注明品牌。二、杂质检查方法的建立30（2）流动相的选择尝试多种流动相结合杂质的性质 -手性杂质

13、-无紫外吸收杂质 -一般杂质 （3）洗脱方式的选择 等度洗脱 梯度洗脱：极性大的化合物可能被掩盖，极性小的化合物难以被洗脱，甚至保留在柱上，可适用梯度洗脱。 二、杂质检查方法的建立31梯度洗脱与等度洗脱条件下有关物质的分离情况二、杂质检查方法的建立32（4）波长的选择-选择的原则是大部分主要杂质与主成分均在此波长下有吸收二极管阵列方法-无紫外吸收或检测波长处吸收相差较大的多种化合物，有时在单一检测波长处不能检出-兼顾各杂质吸收情况；特定波长检测特定杂质-必要时，改用其他类型检测器二、杂质检查方法的建立33三、杂质检查方法验证的要求34（5）样品的处理和配制-预处理样品的考虑乳膏提取可能导致的杂

14、质漏检和失真衍生化处理导致的杂质丢失-样品浓度的影响浓度高利于杂质的检出，但防超载低浓度样品杂质的检查难题？二、杂质检查方法的建立35（6）杂质的定量计算方法 -杂质对照品法定量准确，已知杂质，需用杂质对照品 -校正因子的主成分自身对照法定量准确，已知杂质，无需长期提供对照品 -不加校正因子的主成分自身对照法前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同有一定误差，可用于未知杂质已知杂质对主成分的响应因子在0.91.1之间 -峰面积归一法简便因杂质与主成分响应因子不同、线性范围不同、仪器对它们的积分精度及准确度不同等因素，有一定的局限性二、杂质检查方法的建立36目前定量方法中存在的主要问题-杂质对照

15、品法较少使用-主成分自身对照法较少采用校正因子计算杂质无法进行归属或杂质对照品无法得到校正因子无法计算-常见的是对未知杂质，不加校正因子的主成分自身对照或面积归一化法无法准确定量无法有效检测杂质二、杂质检查方法的建立37TLC法-设备和操作简便，一些特定杂质的检查-灵敏度较差、定量不够精确，分离度欠佳，有时无法满足需要-仅限于限度检查（半定量），结合不同原理的检视技术能使各杂质斑点均可显示，弥补HPLC的不足-需做好系统适用性试验二、杂质检查方法的建立38 -定量方法限度检查（半定量）对照品比较法已知杂质，对照品自身对照法已知杂质、未知杂质，色调一致检视技术显色、荧光、自身颜色等二、杂质检查方

16、法的建立39LC-MS/GC-MS/GC-IR/CE-MS法-分离技术和鉴别技术联用，为解析化合物的结构提供直接证据-有助于杂质谱的分析和定性二、杂质检查方法的建立40方法验证的目的-考察分析方法是否适用于杂质的检测和定量方法验证中面临的困难-杂质谱不清-杂质对照品无法获得验证的具体要求三、杂质检查方法验证的要求411、专属性指在可能的共存组分存在时，对被分析物准确测定的能力。分离度-专属性指标-杂质谱的明确是基础杂质可得最难分离物质对的分离试验、粗品中间体分离试验、辅料与杂质及主成他的分离试验杂质不可得强制降解试验、与另一成熟方法比对峰纯度-二极管阵列、质谱；改变流动相比例方法不够专属时，应

17、多个方法予以补充三、杂质检查方法验证的要求42降解试验的注意点-降解程度-当降解产物、中间体、副产物吸收波长不同时的处理-制剂降解破坏-消除辅料的干扰，当无法避开辅料的干扰时应对辅料进行定位予以扣除三、杂质检查方法验证的要求43破坏性试验-酸降解一般釆用0.1mol/L-1mol/L盐酸或硫酸-碱降解釆用0.1mol/L-1mol/L氢氧化钠溶液-氧化降解釆用合适的过不去氧化氢溶液-必要时可以加热或提高浓度-高温试验通常温度高于加速试验温度的10，50、60等-对于原料药有时需考虑水溶液或混悬液的降解-考虑在不同PH值条件下的降解-光照试验条件可釆用4500LX三、杂质检查方法验证的要求44存

18、在的主要问题：-（1）主药完全降解，无法对降解产物进行有效检测-（2）由于选择的降解条件强度不够，使药物未能降解，而误认为药物稳定-（3）不能选择合适测定方法测定降解产物，使主成分降解后测定的回收量偏低-（4）未考虑破坏性试验时产生的聚合物三、杂质检查方法验证的要求45三、杂质检查方法验证的要求462、灵敏度-试样中能被检测（或定量）的最低量。-通常用检测限及定量限表征，可根据直观评价、信噪比、响应值的标准差和斜率获得。-应满足质控需要-信噪比的方法三、杂质检查方法验证的要求47三、杂质检查方法验证的要求483、精密度-在规定的测试条件下，同一个均匀样品经多次取样测定所得结果之间的接近程度-重

19、复性、中间精密度、重现性三、杂质检查方法验证的要求494、准确度-测定结果与真实值或参考值接近程度-已知杂质：回收率（根据精密度、专属性、线性）推断-未知杂质：与另一成熟方法比对、根据质量平衡原理结合含量等结果进行粗略判定，必要时研究几种不同色谱条件甚至不同测定原理的方法进行比较选用三、杂质检查方法验证的要求505、线性-在设计范围内，检测响应值与待测物质量之间成正比关系的程度。6、-检测方法能达到一定精密度、准确度和线性的高、低浓度或量的区间-范围应在规定限度的20%间或定量限至限度的20%间，若含量测定和杂质检查同用一套色谱系统，则线性范围应为杂质限度的-20%至含量限度（上限）的+20%

20、间三、杂质检查方法验证的要求517、耐用性-指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度-HPLC：流动相的组成比例及PH值、不同产家或批号的色谱柱、柱效、柱温、流速等及被测溶液的稳定性、样品提取的次数和时间等建议固定上述测定条件的参数，如柱长、填料的粒度、温度、流速，甚至品牌-TLC：适当改变展开剂比例及PH值，考察耐用性。如对色谱条件要求苛刻时，规定最难分离物质对试验-较容易忽略三、杂质检查方法验证的要求528、溶液的稳定性考察-一般在常温、常光情况下进行，对同份样品溶液进行时间的测定，以杂质量的变化进行考查。-光或温度引起，应在标准中说明避光或实验温度三、杂质检查方法验证的要求53

21、9、系统适用性-理论板数-柱拖尾因子-难分离物质对的分离度-对照品溶液得复进样的偏差否则，应对色谱系统作必要的调整或更换色谱柱杂质检查方法验证实例.doc三、杂质检查方法验证的要求541、简单套用被仿制药的检查方法，未建立针对性的方法盐酸伪麻黄碱，分别釆用人工合成与植物提取工艺，有机溶剂残留量、有关物质均不同2、方法学验证不充分-如强制降解条件过于剧烈，无法判断主峰与降解产物的分离度情况-样品经碱解、氧化破坏后主药被完全破坏，无法说明其降解物与主峰的分离情况-调整降解条件的剧烈程度四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析553、检查方法对杂质的控制不全面，尤其是对毒性杂质某药间位和对位异构体的检

22、查脂质体溶血磷脂的检查四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析56案例间位和对位异构体的控制合成工艺简介四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析57合成原料中的异构体杂质产生的杂质四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析58以杂质对照品验证HPLC方法的检测能力四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析59建议的质量保证策略过程控制：控制合成原料的纯度终产品控制：检查终产品残留的结构异构体四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析60脂质体溶血磷脂的检查四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析614、方法灵敏度不够-有关物质检查法的定量限为0.75ng，标准规定杂质限度不得过1.0%，折算为0.5ng，表明此方法不能有效检测产品杂质，需重新建立有效的杂质检测方法5、方法缺乏互补性-合成中重要中间体检测波长处无吸收，建立的有关物质检查方法无法检测该物质-建立该中间体适宜的要检测方法四、杂质检查方法和方法验证常见问题分析626、积分时间不充分，不能有效检出杂质-氧化破坏试验中，主峰保留时间的3倍处，仍有降解物峰出现，色谱图记录至2倍，不能有效检出有关物质-改进7、检测波长缺乏针对性-220nm附近的吸收强度远高于