02 消毒与灭菌 微生物与免疫学

1、第二章消毒与灭菌 (理化因子控制微生物)一、几个基本概念抑菌(Inhibition)：生长停止，但不一定死亡；无菌操作(Antiseptic technique)：防止微生物污染的操作。防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长；无菌(Asepsis)：不存在任何活菌；消毒(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；灭菌(Sterilization)：杀死包括芽孢在内的所有微生物；理化因子抑菌、杀菌作用的相关因素：理化因子的强度或浓度；同一浓度理化因子作用时间的长短；不同种类的微生物；同种微生物的不同生长时期；（一）灭菌（sterilizati

2、on） 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。Eg. 高温灭菌、辐射灭菌等 杀菌（bacteriocidation）溶菌（bacteriolysis）菌体虽死，但形体尚存菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象灭菌（二）消毒（disinfection） 消 除 毒 害“毒害”就是指传染源或致病菌 消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。Eg. 对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法，等等。（三）防腐（antisepsi

3、s） 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。防腐的措施（1）低温（2）缺氧（3）干燥 （4）高渗（5）高酸度 （6）高醇度（7）防腐剂防腐剂和消毒剂特点： 对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内的化学治疗。消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。杀灭或抑制微生物的物理因素温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波等二、物理灭菌温度 当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。(一) 高温灭菌的种

4、类 高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。1. 干热灭菌法（dry heat sterilization） 烘箱内热空气灭菌干热灭菌火焰灼烧 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170下维持12小时后，即可达到彻底灭菌的目的。 灼烧（incineration或combustion）是一种最彻底的干热灭菌方法，其破坏力很强，故应用范围仅限于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。细胞膜破坏蛋白质变性原生质干燥各种细胞成分发生氧化干热2. 湿热灭菌法（moist heat sterilization） 湿热灭菌法是

5、指用100以上的加压蒸汽进行灭菌。湿热比干热灭菌更好：湿热蒸气透射力强，更易于传递热量；更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：多数细菌和真菌的营养细胞：在60左右处理5-10分钟；酵母菌和真菌的孢子：用80以上温度处理；细菌的芽孢：121处理15分钟以上；（1）常压法1）巴斯德消毒（pasteurization）6085处理15s30min低温湿热消毒法低温维持法（LTH，low temperature holding method）高温瞬时法（HTST，high temperature short time）在63下保持30min可进行牛奶消毒牛奶消毒时只要

6、在72下保持15秒钟即可巴氏消毒法专用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。 可杀灭物料中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味，但不能杀灭引起Q热的病原体Coxiellaburnetii（伯氏考克斯氏体，是一种立克次氏体）。2）煮沸消毒100 处理1530min一般用于饮用水的消毒3）间歇灭菌（fractional sterilization或tyndallization）80100 下蒸煮1560min，室温或37下保温过夜，循环三次。 此法又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。例如，培养硫细菌的含硫培

7、养基用间歇灭菌法灭菌，因其内所含元素硫在99100的温度下可保持正常结晶形，而常规的加压灭菌（121）后会引起硫熔化。（2）加压法1）常规加压蒸汽灭菌法（normal autoclaving）121（压力为1kgcm2或15磅英寸2），1520min；115（0.7kgcm2或10磅英寸2），35min； 一般称作“高压蒸汽灭菌法”。这是一种利用高温进行湿热灭菌的方法。优点：操作简便、效果可靠，广泛使用。高压蒸汽灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌 。5）连续加压蒸汽灭菌法（continuous autoclaving ）135140，5-15

8、s，工业上发酵培养基135150，2-6s，牛奶或其它液态食品（超高温灭菌） 在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。主要操作是将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。利用温度进行杀菌的定量指标 也称热致死时间，指在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。（1）热死时间（thermal death time）Eg. E. coli在60下为10min；Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）在58下为30min等。（2）热死温度（thermal death point） 也称热死点，指在一定时间内（一般为10min

9、），杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。Eg. Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌）为53；Erwinia carotovora （胡萝卜软腐欧文氏菌）为4851等 。（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素 1.杀菌物体含菌量 不同的微生物个体（包括营养体和孢子）的耐热性是有差别的。一般灭菌物体中的含菌量越高，需要的灭菌时间越长。2.灭菌锅内空气排除程度 在一切利用加压蒸汽灭菌法的场合下，必须做到彻底排除灭菌锅内的残余空气 。灭菌锅上同时装有压力表和温度计3.灭菌对象的pHpH6.08.0时，微生物较不易死亡；pH6.0时，最易引起死亡。4.灭菌对象的体积 灭菌对

10、象体积的大小会影响热的传导速率。在实验室工作中，对大容量培养基灭菌时，必须注意相应延长灭菌时间。5.加热与散热速度 根据季节的变化或灭菌物件体积的大小，确定相应的“上磅”（预热速度）或“下磅”（散热）时间。（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止 1.有害影响高温，尤其是长时间的高温除对培养基中的淀粉成分有促进糊化和水解等少数有利影响外，一般对培养基成分产生很多不利的影响。产生褐变的机制由氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质）与羰基化合物（糖类）间发生复杂的梅拉特反应（maillard reaction）所引起，它在导致培养基褐变的同时，还降低了有关营养物成分，应尽量设法避免。2.防止法（1）采用特

11、殊加热灭菌法 对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，再混合，不易形成磷酸盐沉淀；对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌等。（2）过滤除菌法 对培养液中某些不耐热的成分可采用过滤除菌法“灭菌”。缺点：无法滤除液体中的病毒和噬菌体。各种滤器（filter）例如，滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器（Seitz filter）、素烧瓷过滤器（Chamber

12、land candle）、硅藻土过滤器（Berkefeld candle）等。（a）注射式微孔滤器 （b）小型过滤装置 （c）层流生物安全柜 棉花、玻璃纤维或石棉微孔滤膜0.220.45醋酸纤维素、硝酸纤维素核孔滤器过滤除菌（3）其他方法 加入0.01EDTA（乙二胺四乙酸）或0.01NTA（氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀； 用气体灭菌剂如氧化乙烯（环氧乙烷）等对个别成分进行灭菌处理，在混入以灭过菌的其它培养基成分中。 辐射灭菌（Radiation Sterilization）是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波二、物理灭菌

13、辐射作用微波紫外线（UV）X-射线-射线1、紫外光200300nm范围的紫外光杀菌作用最好。杀菌作用机制：使蛋白质（约280nm）和核酸（约260nm）吸收变性失活；也可产生有毒的光化学产物-自由基，结合到DNA、RNA和蛋白质分子上，干扰细胞的代谢过程。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张或大多数其他物体，但能够穿过空气。主要用作物体表面或室内空气的杀菌。2、电离辐射主要使用X射线和射线。当X射线或射线撞击分子时，形成离子和自由基分子。电离辐射产生H2O2，使蛋白质发生变化，细胞受到损伤或死亡。电离辐射主要用于其他方法所不能解决的塑料制品、医疗设备、药品和食品的灭菌。3.强可见光 4

14、00700nm波长范围的强可见光也具有直接的杀菌效应，它们能够氧化细菌细胞内的光敏感分子，如核黄素和卟啉环（构成氧化酶的成分）。 实验室应注意避免将细菌培养物暴露于强光下。此外，曙红和四甲基蓝能够吸收强可见光使蛋白质和核酸氧化，因此常将两者结合用作灭活病毒和细菌。微波：微波的范围在9152450 MHz/s之间。机理：微波产生热效应，使蛋白质、酶等物质 变性，导致微生物死亡。 缺点：由于微波加热食品通常存在不均匀问题,微生物逃逸微波加热现象常会发生。 4.微波超声波：每秒钟振动在1600以上的声波。机理：引起膜破坏，细胞破裂，内涵物逸出。 超声波杀菌效力大小与频率、强度、处理时间等多种因素有关

15、。三、物理灭菌超声波其它作用：破碎细胞，提取胞内物质（代谢产物、酶等） 干燥并不一定杀死微生物，但因使细胞造成代谢停止而抑制微生物生长，有时也可引起某些微生物细胞的死亡。不同微生物种类对干燥的敏感性：淋病球菌 对干燥敏感 几小时便死亡结核分支杆菌 耐干燥 10020min仍能生存链球菌 耐干燥 保存几年而不丧失致病性休眠孢子 抗干燥能力强 在干燥条件下可长期不死四、物理灭菌干燥五. 物理灭菌渗透压 增加渗透压是另一种通过限制微生物可利用水而控制其生长的方法。高渗环境中，水从细胞中流出，使细胞脱水。像盐腌制咸肉或咸鱼，糖浸果脯或蜜饯等均是这一方法在食品保存中的应用。物理抗菌（学生填空）方法作用机

16、理举例干热灭菌蛋白质变性湿热灭菌蛋白质变性巴斯德消毒法冷藏减慢酶促反应冷冻干燥抑制酶活性物理抗菌（学生填空）方法作用机理举例冷冻干燥脱水抑制酶活性紫外线蛋白质和核酸变性离子辐射蛋白质和核酸变性微波吸收水分子后微波以发热形式释放强可见光氧化光敏性物质声波和超声波空化效应膜过滤机械去除渗透压巴斯德消毒牛奶是无菌产品吗？微波可有效杀死芽孢杆菌？一边工作一边可以用紫外进行消毒？六、化学消毒灭菌抗微生物剂非选择性（对所有细胞均有毒性）有选择性（对病原微生物毒性更强）消毒剂（Disinfectant）防腐剂（Antisepsis）抗代谢药物抗生素中草药有效成分（化学治疗剂） 评价表面活性剂、化学杀菌剂、防

17、霉剂、农药或化学治疗剂等的药效和毒性的3种指标。最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）半致死剂量（50 lethal dose，LD50）最低致死剂量（minimum lethal dose，MLD） 评定某化学药物药效强弱的指标，指在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。 评定某药物毒性强弱的指标，指在一定条件下，某化学药物能杀死50试验动物时的剂量。 评定某药物毒性强弱的另一指标，指在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100死亡率的最低剂量。化学物质的抗微生物能力的测定液体培养法最低抑制浓度（minimum inhibito

18、ry concentration，MIC）实验平板培养法抑菌圈（zone of inhibition）试验纸片扩散法能区分杀菌或抑菌作用吗？（一）表面消毒剂（surface disinfactant） 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。共同规律：当其处于低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数（phenol coefficient，P.C.）： 指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌（test organism）的最高稀释度与

19、达到同效的石炭酸的最高稀释度的之比。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为鼠伤寒沙门氏菌（消化系统）和金黄色葡萄球菌（普通伤口）。 在临床上最早使用的消毒剂石炭酸石碳酸系数为1：消毒效力与石碳酸相比？系数小于1：？系数大于1：？许多微生物学家最低抑菌浓度比石碳酸系数更有意义。化学药剂金黄色葡萄球菌鼠伤寒沙门氏菌苯酚11乙醇6.36.3福尔马林0.30.7双氧水-0.01来苏儿5.03.2碘酒6.35.8氧化汞100143氯胺133100甲酚2.32.3表面消毒剂广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌：温度计、带有透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等；墙壁、楼板与仪器设备等表面和

20、自来水；空气；乙醇消毒时浓度越高，杀菌效果越强？为什么？ 乙醇消毒：需要水分，因其机理是使菌体蛋白凝固；乙醇水溶液渗透性更强。（二）抗代谢药物磺胺类药物 抗代谢药物（antimetabolite）又称代谢拮抗物或代谢类似物（metabolite analogue），是指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。 抗代谢物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行。它具有良好的选择毒力，是一类重要的化学治疗剂，多为有机合成药物。叶酸对抗物（磺胺类） 嘌呤对抗物（6-巯基腺嘌呤） 苯丙氨酸对抗物（对氟苯

21、丙氨酸） 尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶） 胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶） 等等磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病。大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等）某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用。1934年，德国I. G. Farben染料厂的G. Domagk：一种红色染料（prontosil，百浪多息），白鼠静脉注射，可治疗因链球菌引起的感染，但在体外却无作用。1935年，进一步证明prontosil对人的链球菌病也有效。法国人Trefouel和英国人Fuller：prontosil在体内转化成了具有抑菌作用的磺胺磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物作用机理： 二氢蝶啶 +对氨基本甲酸 二氢叶酸 四氢叶酸 辅酶F磺胺药 核酸合成二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶磺胺药作