基因工程基因工程概述课件

1、第二章 基因工程第一节 基因工程概述一、基因工程的含义按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含义。 第一节 基因工程概述二、基因工程研究的理论依据（一）不同基因具有相同的物质基础（二）基因是可以切割的（三）基因是可以转移的（四）多肽与基因之间存在对应关系（五）遗传密码是通用的（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第一节 基因工程概述三、基因工程操作的基本技术路线第一节 基因工程概述四、基因工程研究最突出的优点打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核

2、生物之间、动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动植物中表达。第二节 DNA重组一、DNA概述（一）DNA的组成和结构双链DNA示意图 第一节 基因工程概述终止子发夹结构模式 一、DNA概述（二）DNA的功能1. DNA分子能在细胞内复制2.携带遗传信息第二节 DNA重组二、目的DNA片段的获得（一）限制性内切核酸酶和DNA片段化1. 限制性内切核酸酶2. 限制性内切核酸酶的识别序列3. 限制性内切核酸酶的酶切位点4. 限制性内切核酸酶反应系统5.用限制性内切核酸酶酶切DNA的方法限制性内切核酸酶

3、酶切DNA的位点和酶切片段的末端 DNA酶切片段电泳示意图 第二节 DNA重组二、目的DNA片段的获得（二）特异性DNA片段的PCR扩增1.PCR基本原理2.耐热性DNA聚合酶3.PCR引物4.DNA片段PCR扩增系统 PCR扩增特异性DNA片段过程 第二节 DNA重组二、目的DNA片段的获得（三）DNA片段的化学合成1.合成引物2.合成DNA寡核苷酸连杆3.合成基因片段第二节 DNA重组三、DNA片段的连接（一）DNA连接酶（二）DNA片段之间的连接1. 互补黏性末端片段之间的连接2.平末端DNA片段之间的连接3.DNA片段末端修饰后进行连接4. DNA片段加连杆或衔接头后连接第二节 DNA

4、重组三、DNA片段的连接（三）DNA重组类型1.插入重组2.置换重组第三节 基因克隆载体一、质粒载体（一）大肠杆菌质粒载体第三节 基因克隆载体一、质粒载体（二）蓝藻和大肠杆菌穿梭质粒载体第三节 基因克隆载体一、质粒载体（三）农杆菌Ti质粒载体（四）酵母2m质粒载体用于植物转基因的克隆载体示意图 第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体（一）噬菌体克隆载体1.噬菌体克隆载体第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体（一）噬菌体克隆载体2.cosmid载体第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体（二）植物病毒克隆载体35S启动子表达载体示意图 第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）

5、克隆载体（三）动物病毒克隆载体 痘苗病毒载体示意图 第三节 基因克隆载体三、人工染色体载体大片段克隆载体 HAC构建示意图第三节 基因克隆载体三、人工染色体载体大片段克隆载体第三节 基因克隆载体四、体内同源重组整合载体（系统）（一）常规基因定位整合系统第三节 基因克隆载体四、体内同源重组整合载体（系统）（二）基于噬菌体P1的CreLox定位重组系统 Cre介导几种可能发生的重组方式P:启动子； ：loxp；a、b、c、d、e、f、g、h：相关基因第四节 目的基因的制备一、目的基因的来源目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，特别是人和动植物染色体中蕴藏着大量的基因，是获得目的基因的主

6、要来源原核生物的染色体基因组也是目的基因来源的候选者 质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组也有少量的基因 第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径（二）利用PCR直接扩增目的基因第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径（三）目的基因的化学合成第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径（四）通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因1.基因组文库第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径2.cDNA文库第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径3.从基因组文库或cD

7、NA文库中获得目的基因第五节 目的基因导入受体细胞一、受体细胞（一）原核生物细胞（二）真核生物细胞第五节 目的基因导入受体细胞二、重组DNA分子导入受体细胞（一）外源DNA转化方法化合物诱导转化法 致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 电穿孔转化法微弹轰击转化法 激光微束穿孔转化法 超声波处理转化法 脂质体介导转化法 体内注射转化法 花粉管通道转化法 精子介导法 低能离子束介导转化法 第五节 目的基因导入受体细胞二、重组DNA分子导入受体细胞（二）病毒（噬菌体）颗粒转导法用病毒（噬菌体）的DNA（或RT-DNA）构建的克隆载体（或携带目的基因），在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使

8、其携带的重组DNA进入受体细胞。将此过程称为病毒（噬菌体）颗粒转导（transduction）法,主要用于构建基因文库和动物的转基因，早期也用于植物的转基因。第五节 目的基因导入受体细胞三、克隆子的筛选（一）根据载体标记基因筛选转化子1.根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子第五节 目的基因导入受体细胞三、克隆子的筛选（一）根据载体标记基因筛选转化子2根据载体除草剂抗性基因和相应的性质药物筛选转化子3.根据lacZ基因互补显色筛选转化子4.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子5.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子第五节 目的基因导入受体细胞三、克隆子的筛选（二）

9、根据报道基因筛选重组子1. -葡萄糖酸苷酶基因（gus）2.萤火虫荧光素酶基因(luc)3.绿色荧光蛋白基因（gfp） （三）根据形成噬菌斑筛选转化子第六节 重组子的鉴定一、根据重组DNA分子特征鉴定重组子（一）根据重组DNA分子大小鉴定重组子（二）根据重组DNA分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子（三）根据PCR扩增片段鉴定重组子（四）采用DNA杂交法鉴定重组子（五）应用DNA芯片鉴定重组子（六）根据DNA核苷酸序列鉴定重组子第六节 重组子的鉴定二、根据目的基因转录产物mRNA鉴定重组子三、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子（一）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子（二）免疫检测法鉴定

10、重组子1.酶联免疫吸附法2. Western印迹法3.质谱分析法第七节 基因工程的应用和安全性问题一、基因工程的应用二、基因工程的安全性问题植物基因组DNA的提取一、实验目的理解提取基因组DNA的原理，学习植物基因组DNA的提取方法。 植物基因组DNA的提取二、实验原理利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞。在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨。离子型表面活性剂，能够使DNA得以游离出来。苯酚和氯仿能使蛋白质变性，并使抽提液分相，经离心后除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇使DNA沉淀，大

11、分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，用玻棒取出，小分子DNA形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。絮状DNA沉淀溶于TE溶液中，即得植物基因组DNA溶液。植物基因组DNA的提取三、实验仪器高速冷冻离心机，台式高速离心机，恒温水浴锅，恒温摇床，电热恒温培养箱，超净工作台，低温冰箱，制冰机，高压灭菌锅。实验试剂与用品：TrisCl，EDTA，NaCl，KAc，SDS，RNA酶A，氯仿，异丙醇，无水乙醇，TE，ddH2O植物基因组DNA的提取四、实验步骤1.取幼嫩的组织材料1g，用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500L提取液的离心管中，每个离心管加入0.1g，轻轻混匀。2.向管中加入50L20% SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65保温10min，并不时摇动。3.加入50L5molLKAc，混匀，置冰上2030min.4.4，15000rmin离心15min，转移上清液到新离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20沉淀30min。植物基因组DNA的提取四、实验步骤5. 12000rmin离心10min回收基因组DNA沉淀，