结核病的病原学和实验室诊断

1、结核病的病原学和实验室诊断主要内容结核病的流行情况1结核病的病原学32结核病的实验室诊断3结核病的分子药敏341.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化人口大规模流动结核菌耐药现象益发严重 结核病合并艾滋病感染我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者130万/年死亡13万/年2011 WHO tuberculosis control report我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不

2、超过50%当前结核研究的热点新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%)7/45近期结核病诊断方法的相关研究JID 2012:205 (Suppl 2), S147.2.结核病的病原学 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。2022/8/10GDTB8结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1. 细胞壁中含有大量脂质2.引起的

3、疾病都呈慢性，并伴肉芽肿生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要1520小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要1520小时，在家兔角膜中约需要2022小时。实验室检查方法的历史1880sTubercle bacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test (TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培养基1940sDubos agar, Ogawa 培养基1950sM

4、iddlebrook 7H91990sNAAT2000sELISPOT, QuantiFERON,2010sLPA, GeneXpert2020s ?3.结核病的实验室诊断 细菌学涂片：敏感性低传统固体培养：所需时间长，23月 分子生物学TB-DNATB-mRNA 血清/免疫学IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题液体培养及药敏试验：平均时间20天.细菌学诊断萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/药敏试验我国目前最常用的结核病实验室诊断技术快培/药敏试验涂片 干燥 固定初染脱色复染 显微镜检查登记/报告显微镜检查碱性复红盐酸酒精亚甲兰石炭酸金胺

5、O盐酸酒精高锰酸钾光学显微镜检查荧光显微镜检查萋尼氏染色镜下形态荧光染色镜下形态LED Fluorescence microscopyLED荧光显微镜LED 荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜寿命长（ 15-20,000小时）省电可用电池供能可靠性更强不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜操作人员工作负荷减轻普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均）显微镜方法灵敏度 (%)特异度 (%)普通荧光显微镜直接涂片67.496.1普通荧光显微镜浓集涂片66.699.2发光二极管 荧光显微镜直接涂片71.6 (p=

6、0.1025)96.4发光二极管 荧光显微镜浓集涂片72.4 (p=0.0073)98.8BactecMGIT 960/320Bact/Alert 3DVERSA TREK生产厂家美国BD公司法国生物梅里埃公司美国Trek 诊断公司 仪器定位专业分枝杆菌检测系统业内金标准普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件单机容量960个检测位每年可至少检测8000个样本240个瓶位每年可检测2000个样本528个瓶位日均标本处理量2530个67个9个检测原理荧光增强法：采用敏感性较强的荧光信号探测氧气的变化情况，只需单一反应，所以速度快，准确性高PH值比色

7、法：当培养瓶内有微生物生长，其释放出的CO2，经水饱和后，产生H+，使PH值产生变化，感应器的颜色也随之变化。需双重反应，因此速度较慢，假阳性率较高，此技术已趋向淘汰压力检测：检测细菌生长中各种气体产生和消耗而引起的瓶内压力的变化。灵敏度差。此技术已趋向淘汰检测技术瓶外检测技术瓶外检测技术瓶内检测技术易导致污染及生物安全问题平均阳性报告时间 811天1521天不详药敏试剂5种一线抗TB药物，全部具有FDA及SFDA认证无药敏试剂提供只有3种一线药物培养/药敏试验阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FF

8、FFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物肉汤改良Middlebrook 7H9肉汤上部空间已预先充填10% CO2BACTEC MGIT 960/320 指示器系统MGIT /3D制造的液体培养基优点比固体培养快 (平均 10-12 天 vs. 20-24 天)比固体培养基更敏感可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读也加快了药敏试验的速度局限需要NALC-NaOH进行痰处理和离心普通菌群的污染很常见比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定比固体培养基昂贵血清学诊断血清学诊断技

9、术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(Western Blotting)等等WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%60%，特异度为5399% 1 。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHO World Hea

10、lth Organization. Diagnosis evaluation series No.2: laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.WHO对结核抗体评估2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1 。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of T

11、uberculosis. 不能早期诊断！容易漏诊、误诊！血清学检测的评价结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In

12、 Tube（QFT-GIT）2）英国蛋白水平分子诊断:-干扰素释放实验（IGRA)-干扰素释放实验（IGRA） 干扰素检测阴性干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素T-SPOT.TB原理T-SPOT.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，

13、CFP 10）结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6与CFP-10抗原结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲T-SPOT.TB临床性能指标 特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(62

14、4/655)灵 敏 度ReferenceSensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0% (12/12) Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3% (20/24) Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6% (84/87) Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3% (21/23) Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9% (70/7

15、3) Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*92.2% (59/64) Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3% (57/58) Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0% (27/30) Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9% (26/28) Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9% (26/28) Soysal et al IJTLD 200

16、8 12(1):50-56*80.8% (80/99) Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7% (36/42) Chee et al J Clin Microbiol. 2008 Apr 9*94.1% (254/270) Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8*84.6% (11/13) Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-887.2% (34/39) Losi et al Eur Respir

17、J. 2007 Dec;30(6):1173-9100.0% (10/10) Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259100.0% (22/22) Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624*100.0% (9/9) Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34*87.5% (42/48) Kobashi et al. J Infect. 2008 Epub ahead of print.*90.0% (36/40) Domnguez et al. Di

18、agn Microbiol Infect Dis. 2008.* Epub ahead of print84.2% (32/38) Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.*89.9% (62/69) Bosshard et al. Respir Med. 2008. Epub ahead of print98.4% (62/63) Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. Epub ahead of print*95.9% (47/49) TOTAL92.0% (1139/1238) 特 异 性T-SPOT.TB

19、的实验步骤用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌-干扰素效应T淋巴细胞分泌的-干扰素与膜板预包被的抗-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞加入显色液，观察结果过夜孵育，洗板，加入酶标二抗阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）实验效果图方法学的优点检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散快速48小时出结果方法学的局限不

20、能区分活动性TB与潜伏感染不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者检测收费高（800元/次）实验结果的解释 阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：感染阶段不同；少数免疫系统功能不全/疾病；实验非正常操作。 阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果： 4种环境分枝杆菌感染时：（堪萨斯）、（苏氏）、（海）、（戈登）各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群美国指南加拿大指南英国指南免疫力抑制人群

21、（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-抑制剂治疗）TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查TST，如果TST阴性要用IGRA确认TST或IGRABCG接种者（如果也属于其它风险人群）推荐用IGRA没有特定的推荐TST或IGRA与传染性肺结核患者密切接触TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性医务工作者TST或IGRA推荐用TSTTST或IGRA，视情况而定无法再来确认TST结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）推荐用IGRA没有特定的推荐推荐用IGRA国外出生的人群只筛查过去5年内移民的人群；TST或

22、者IGRA只筛查过去2年内小于15岁的移民；TST，用IGRA进一步确认TST阳性只筛查新移民；TST筛查5至15岁移民，用IGRA进一步确认TST阳性；IGRA筛查16至35岁移民其它风险人群TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性样本量为26 680 调查者的15个多中心研究显示,在4年的随访中,IGRA-阳性的个体中发病数为448 例/1000人/每年. 2011年9月的研究结果提示，IGRA-阴性对于儿童（小于5岁）不能排除结核病(Pediatr. Infect. Dis. J.30, 817818, 2011). Childhood

23、 tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.TB-DNA检测：1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强。2. 早期、快速、准确地诊断结核病。 痰液、肺及支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4. TB-DNA浓度可用于判断疗效： 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势

24、，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据 。分子生物学诊断Real-time PCR 环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65)下保温3060分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。环介导恒温扩增（LAMP）技术2小时全过程目测法检测流程检测方法说明结果判断 在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下： 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检

25、测结果为结核分枝杆菌阳性； 若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性； 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA 拷贝数 DNA拷贝数更具临床意义: 生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标结核杆菌RNA(TB-RNA)SAT技术原理操作过程4. 结核病的分子药敏HAIN 技术DNASTRIPT-spot -Xpert MTB/ RIFDNA微阵芯片探针熔解曲线技术药物药物作用机制参与基因编 码 酶作 用突变频率（%

26、）INH氧自由基对DNA，脂质等多效应Kat G触酶-过氧化物酶活化原药4258INH对NADH竞争性INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成代偿katG功能inhAkasAahpCndhnat glf烯酰基载体蛋白还原酶酮酰基蛋白合成酶烷基氢过氧化物酶NADH脱氢酶芳香胺乙酰转移酶吡喃半乳糖变位酶分支菌酸代谢靶酶靶酶？ 靶酶？NAD+ 减少乙酰化失活INH靶酶？21341015耐药标记物RFP抑制信使RNA转录rpoBRNA多聚酶靶酶96100PZA酸化胞浆，失活酶活性抑制脂肪酸代谢？替代烟酰胺掺入NAD抑制膜转运功能pncAFasI吡嗪酰胺酶Fas I？活化原药靶酶？7297EMB阿拉伯半乳

27、聚糖合成抑制阿拉伯呋喃糖累积脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制embCABembB阿糖转移酶靶酶4765SM肽链翻译错误rpsLrrs核糖体30S亚基S12蛋白核糖体16SrRNA靶位靶位5259821AK/KMOFx肽链翻译错误抑制DNA回旋酶rrsgyrA核糖体16SrRNADNA回旋酶A亚基靶位靶酶7594Cs抑制肽聚糖合成ulrA/dadBD-丙氨酸合成酶靶酶原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。检测标本：涂阳痰标本/TB-DNA阳性标本固体或液体培养菌株 Hain 技术GT-Blot 48自动杂交仪1台 所需设备：GTQ PCR

28、96扩增仪1台 Mikro 220 离心机1台 恒温器1台超声波振荡仪1台 TARGET靶基因菌种鉴定16SrRNA IS6110异烟肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh 利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺 pncA链霉素 rpsL、rrs喹诺酮类药物 gyrA、gyrB MTBDRplus 方法原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点，诊断RFP和INH耐药。rpoB 野生型探针: WT1 - WT8rpoB 耐药突变探针: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 通过缺失的野生型信号进行突变探测 通过出现的突变信号

29、进行突变探测MTBDRplus rpoB511513516518522526531533rpoB WT2rpoB WT4rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7rpoB MUT1 (D516V)rpoB MUT3 (S531L)rpoB MUT2A (H526Y)rpoB MUT2B (H526D)514515rpoB WT1rpoB WT3rpoB WT5509508505MTBDRplus 操作流程DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2) PCR扩增3) 杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4) 结果判读MTBDRplus 反应条带(示范)Bandelette MTBDR

30、(Hain Lifescience) 鉴定结核菌利福平rpoBINHkatG 315药物GenoType MTBDRplus结果比例法药敏结果 耐药 敏感 INH 耐药 45 0 敏感 7 16灵敏度：86.5% (45/52)特异度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/68)菌株标本 GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoType MTBDRplus结果比例法药敏结果 耐药 敏感 RFP耐药 48 0 敏感 1 16灵敏度：98.0% (48/49)特异度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65)菌株标本 GenoType MT

31、BDRplus方法与比例法药敏试验结果比较痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoType MTB DRplus结果比例法药敏结果 耐药 敏感 INH 耐药 63 0 敏感 1 129灵敏度：98.4% (63/64)特异度：100%(129/129)符合率：99.5%(192/193)痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoType MTBDR plus结果比例法药敏结果 耐药 敏感 RFP 耐药 39 12 敏感 2 140灵敏度：95.1% (39/41)特异度：92.1% (14

32、0/152)符合率：92.7% (179/193)优点：Hain 技术可以快速检测RFP和INH的耐药时间短、操作简单、安全高 特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠缺点:需要专门设备；未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药物的耐药基因型；MTBDR plus试剂盒的检测试纸条，缺少ahpC-oxyR间隔序列范围，否则可进一步提高INH耐药检测的敏感性；不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台此平台由FIND和Cepheid（一个加州公司）所开发痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、 r