免疫组化影响因素与关键步骤

1、免疫组化的影响和关键步骤优质免疫组化染色切片的标准技术与艺朮相结合的结果特异性好、抗原定位准确、阳性与背景对比清晰,细胞结构显示良好,切片完整,无明显的刀痕,厚薄圴一,衬染对比反差强对照为,阳性对照为阳性。图(A-F)为免疫组化各种方法结果图：A-B为免疫荧光直接法,接间法;C.IGSS法-P53;D为S-P法肺肿瘤组织中的EGFR;E为CSA法-CD44v6;F为EnVi法-HPC阳性ERHer-2免疫组化染色过程涉及许多不确定环节，多种常的假可影响染色结果，最终可能出现非正或假阳性现象，干扰对染色结果的判断。如何做到每一张免疫组化染色切片都是优质的,一个字难。影响IHC检测结果之（16）取

2、样评分系统组织处理内容固定时间判读标准检测后检测前固定方式使用图像分析检测方法验证IHC检测检测仪器精准度实验条件检测中步骤对照检测实验试剂抗原修复类型WolC, et al. J Clin Oncol 2007;25:118145.免疫组织化学板块概况染色试剂冲洗buffer抗体稀释液阻断剂显色剂二抗一抗涂抗原修复液脱蜡抗原修复液抗原修复酶盖玻片封片剂片胶防脱玻片石蜡取材固定包埋切片预处理染色封片判读一、固定的影响1.直接影响到IHC和ISH的检测。2.固定时间624h4mm厚的组织,37,4h内完全可以渗透,与组织的结合率为20%,无交联。(Bancroft JD等经计算机模型计算25和3

3、7条件下的不同结合率百分比值)表.不同值固定液固定标本HER-2蛋白免疫组化染色结果(n=86)固定液值(例)阳性(例)阳性率(%)5.0701618.606.0473945.357.0345260.478.0503641.869.0721416.28表. 不同固定时间标本的HER-2蛋白免疫组化染色结果(n=86)固定时间(例)阳性(例)阳性率(%)8h 以下662023.268-12h454147.6712-24h325462.791-3d563034.883d以上691719.77固定不当会导致手工及自动IHC及ISH检测结果出现片状或不正常染色，从而影响IHC检测结果判定固定不全交联过

4、程发生较慢，很易逆转若固定时间过短，会发生交联不全，组织将被下一步的乙醇固定经乙醇沉淀的蛋白其抗原结构会改变，因而不适应于 IHC及ISH检测固定过度固定时间过长可能导致假检测结果，因而影响抗原修复过度多聚化了抗原CD4抗原弥散CD4组织结构不清:文献1.固定超过7天后几乎检测不到心肌的肌红蛋白。2.固定液时间过短会降低目标nAchR抗原的正常表达。3.酸性固定液的重聚作用加快, 使固定效果急骤下降。4.碱性固定液中, 抗原物质破坏,易产生背景染色, 影响切片附着,造成脱片。5.中性假象。值条件固定液可最大程度避免色素形成, 减少人工原因及克服的办法没有及时固定：尽0min固定液浓度不够：10

5、%中固定液用量不够：是标本体积的10倍定期更换（最多6个月）固定液，标记生产日期或稀释浓度以及过期日固定时间不够：1-2mm/h，小4h，大18h二、前处理方式选择不当1.切片时间最好在免疫组织化学染色检测前才开始切片,如果过早切片，让切片在室温太久，容易造成组织细胞抗原性氧化受损,应尽可能在切片后两星期内进行染色,切片最长保存期为4-6星期。2.切片厚度切片厚度会影响显色及检测数据分析,组织切片厚度标准34m.可用经校准过的石蜡切片机;切片需贴在粘合性强的载玻片上。3.切片质量病理切片质量是保证染色准确性的重要环节之一切片要尽量做到平整，厚度适宜(3-4m)尽量避免刀痕5860恒温箱烤片2h

6、,过高破坏抗原淋AE1/AE3有鳞状细胞涂胶片粘附差色原残留皮肤AE1/AE3冲洗不充分组织冻裂染液出现气泡摊片不平切片皱折切片空洞4.脱蜡耍彻底5.改进骨髓/骨组织脱钙方式用常规脱钙液脱钙后的IHC表达混合脱钙液与EDTA联合应用的IHC表达6.内源性酶的处理一般使用0.3H202或0.3%H202-甲醇来消除内源性过氧化物酶，室温孵育10-20min，有时不够理想可改用酸乙醇室温作用30min，二者比较，动物组织用酸乙醇除内源酶活性要比用0.3H202效果更好。7.非特异染色指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或

7、减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等)；试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等)；组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。未完全封闭内源性生物素不明原因的非特异性染色封闭内源性机染时间：5min3%H2O2预处理5min+机染时间：5min边缘效应不净霉菌污染纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策。三、热抗原修复的影响热抗原修复的分子机制热抗原修复研究进展热抗原修复三要素热抗原修复的应用注意要点热抗原修复的分子机制固定的假设固定的组织其免疫反应性降低是

8、由于使蛋白质发生交联所致, 而且此交联可在很多层面上影响蛋白质的免疫反应性。组织中高浓度的蛋白质可与其他溶质形成一个致密的、不规则网络状的交联(凝胶状) 形式。热抗原修复的分子机制空间位阻假说: Kakimoto等2008在新鲜未固定的大鼠组织切片的IHC染色和大鼠蛋白质提取物点杂交的研究基础上，提出AR的补充机制。推测蛋白质抗原自身的天然空间使抗体与相应抗原表位的接触受限，新鲜蛋白质也不例外。线性表位假设 Fowler和Sompuram等2006在此基础上提出线性表位模型，一些蛋白质经福固定后，三级结构发生改变并形成熔球蛋白；经热诱导AR处理后，蛋白质发生不可逆的变性，从而获得线性表位。热抗

9、原修复的分子机制AR的机制恢复()正常的蛋白质化学成分(抗原表位)、静电电荷耦合以及去除抗原/抗体的空间屏障; 伴随加热诱导抗原修复所致的蛋白质变性则有助于充分对特异性抗体的线性抗原表位。热抗原修复的分子机制为什么搞清楚AR的机制这么难？尽管己有许多科学研究者试图揭示加温抗原修复法是如何导致抗原的。但目前并未完全弄清楚其具体机制。由于机体中所含物质过于复杂，迄今人们未能详细地了解其中每个单一蛋白质/抗原的特征。Sompuram等2004抗原多肽(R、Her2和MIB-1)作为实验模型，涂于玻片上，比较不同处理后的IHC结果：(1)全部固定的均为阳性染色；(2)经固定后，MIB-1(-)，其他均

10、为(+)；(3)先将涂有抗原多肽的玻片浸入酪蛋白液中40min，使酪蛋白附于抗原多肽上，再经固定，全部抗原均为(-)。但经AR后，全部抗原多肽均转为(+)，其染色强度与固定相似。Bogen等2010也进行类似的实验，发现组织经福尔处理后，大多数的独立多肽抗原表位并未失去免疫反应性；若加入不相干的蛋白质，其免疫反应性则，但经热诱导AR处理后，其免疫反应性可恢复。结论:诱导的蛋白质交联阻断多肽抗原表位，而抗原表位氨基酸的组成及顺序是决定AR是否成功的重要。抗原修复机理的几点想法抗原决定簇又称抗原表位（tope.)是指抗原分子上具有决定和控制抗原特异性的特殊化学基团,可与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受

11、体相结合的部位。大多数蛋白质抗原可有多个抗原决定簇,但由于空间位阻作用,在同一时间内仅有部分抗原决定簇和相应的抗体结合。抗原修复机理的几点想法在一个具有三结构的天然蛋白质抗原分子中，由于存在于抗原分子表面的抗原决定簇易被抗体分子识别，从分子的立体构型来看，这些抗原决定簇常分布于抗原分子表面突出的位置上，即肽链的转角或末端，抗原修复机理的几点想法而有些抗原决定簇则被抗原分子本身掩盖在，正常情况下，不能被抗体分子识别，当用高温热时，使蛋白质三维空间构像发生改变，使遮蔽的抗原决定簇。抗原修复机理的几点想法这一点对于解释某些抗原在冰冻切片上AR检测不到，而用了高温处理后，石蜡切片能得到很好地显示。笔者

12、观点抗原修复主耍使组织细胞发生“膨胀”抗原决定簇,今后可能对抗原仅需在一种特殊试剂浸泡几分钟即可,关键如何寻找这样的试剂。AR三大耍素温度时间修复介质谁重耍！没有,适合你的是最好、最佳。AR原则1.高温加热(95120)是影响抗原修复技术的重耍,煮沸以上温度加热应该效率最高,缺点易脱片,但也有例外,如cox2等检测时应选用90,30min。2.AR时间是耍依据温度和修复介质而定,3.修复介质:首耍的是酸碱度,即值。A.偏酸性AR液更适合核抗原,但可产生局部假弱阳性背景,苏木素衬染偏弱;B.碱性的EDTA耍明显优于酸性的CB,复合的修复液耍好于单一的。抗原热修复的影响温度和时间有效性=加热温度（

13、T）加热时间（t）-高温可以缩短修复时间低温需要更长的修复时间隔水修复比直接修复需要更长的时间抗原热修复的方式水浴-最古老的修复方式注意修复时间有重新的趋势微波-修复不均匀高压-简单快捷，但有时会有细胞核的异位染色常用淋巴标记物修复使用的修复液抗体修复标记细胞阳性定位CD3柠檬酸，6.0T细胞胞膜CD20柠檬酸，6.0B细胞胞膜CD30EDTA,9.0T/B细胞胞膜/质CD43柠檬酸，6.0T/B细胞胞膜CD45(LCA)柠檬酸，6.0T/B细胞胞膜CD45RO柠檬酸，6.0B细胞胞膜CD79柠檬酸，6.0B细胞胞核Pax-5柠檬酸，6.0B细胞胞核Bcl-6EDTA,9.0B细胞胞核轻链柠檬

14、酸，6.0B细胞胞质轻链EDTA,9.0B细胞胞质抗原修复10min，即用型原液20min，即用型,1:1稀释机器修复程序：10min20min 25min25min，即用型,1:1稀释细胞核变形柠檬酸,6.0EDTA,9.0打破说明书提供的修复方法，不断摸索，获得最佳染色AR修复方式结果(,病理学杂志)35种抗体中，蒸馏水修复组阳性强度最弱，仅有一个抗体(CD20)染色良好，酸酐修复组31种抗体染色效果良好，柠檬酸修复组30种抗体染色效果良好，EDTA修复液组有28种抗体染色良好。修复液检测例数染色良好(例数)蒸馏水351EDTA3524柠檬酸3528酸酐3530AR修复方式40例不同修复方

15、法的IHC比较标记指标水浴法微波法高压法ER55.0%52.5%52.5%PR57.5%52.5%50.0%CerbB-267.5%62.5%60.0%部分抗体AR与非AR无差异鼠荷瘤模型(FFPF)CD68(Dako,M0718,mAb,IHC-P1:1000),左图消化,右图ARIHC-CD68(Dako,M0718,mAb,IHC-P1:1000)兔ARAR非AR部分抗体非AR耍优于ARIHC-IV(上图0.4%胃蛋白酶37 60min;下图AR)四、IHC试剂(一抗、二抗)的影响1.持异性一抗单克隆抗体-兔、鼠(大小鼠)由单一B细胞系体外产生特异性较高，背景染色较少,反应活性稍亚于多克

16、隆抗体抗体抗体的选择是的，无论是浓缩的抗体还是工作液，在使用前都应最佳稀释。最佳稀释度是指:在无背景染色的情况下,获得最佳强度阳性信号的抗体稀释度。一般染色背景深大部分是抗体浓度过浓所致。不同公司同样抗体所产生的效果是不一样的，选择好的抗体是首要问题。同一种类抗体，不同公司，在相同条件下的修复条件和温度，产生不同的结果。CD30-CD30+克隆号的选择种属适用的组织切片平均分抗体克隆号抗原修复方法兔单抗SP1 SP1 SP1SP1 1D51D5SP1 SP16柠檬酸高压9.825兔单抗兔单抗6柠檬酸高压9.7139.6878 EDTA1h兔单抗6柠檬酸高压9.663ER鼠单抗9.6258 ED

17、TA1h鼠单抗6柠檬酸高压9.625兔单抗9.6258 EDTA1h兔单抗6柠檬酸高压9.575抗体克隆号抗原修复方法兔单抗YR1459 EDTA 煮沸兔单抗YR1459 EDTA 煮沸兔单抗6柠檬酸 高压YR145CD117兔单抗9-78 EDTA 煮沸兔单抗6柠檬酸高压YR145兔单抗YR1459EDTA煮沸兔单抗YR1459EDTA煮沸兔多抗8 EDTA抗体克隆号抗原修复方法鼠单抗 P2D118 EDTA兔单抗 SP4 IR1529EDTA煮沸兔单抗 SP4 IR1529EDTA煮沸兔单抗 SP4CyclinD19EDTA煮沸兔单抗 SP46柠檬酸高压6柠檬酸煮沸兔多抗兔多抗ER2煮沸6

18、柠檬酸 高压兔多抗20min，即用型,1:2稀释20min，即用型,1:1稀释一抗浓度过低20min，即用型,原液20min，即用型,1:1稀释一抗浓度过高一抗染色15min一抗浓度：即用型,1:1稀释一抗染色20min一抗机器染色程序：15min2.特异性一抗体孵育时间和温度免疫组化染色过程的一抗浓度,孵育时间是相关联的，浓度与温度和时间基本呈反比，即浓度高，较高温度，孵育时间短，反之亦然，因此，每个应根据各自的情况，合理处理三者的关系，摸索出一套适合自己的工作条件。常规IHC第一抗体的孵育条件是37室温(25)4h;6过夜。1h,临床病理IHC第一抗体的孵育按说明书提示为室温30-60mi

19、n。实验动物组织中极大部分的第一抗体的孵育需6过夜。某些兔mAb、磷酸化一抗,以及某些核抗原需特殊的孵育条件例如37 8-12h; 6 1-3天,室温过夜;室温3天。多聚物二抗常规15-30min,特殊情况下也可45-80min。HCC-HBs-PS2兔mAb,IHC-P 1:100,cad#:lsc125700;lot#:37335,lifespan37 2h1:20037 4h1:4006 20h1:8003712h1:100037 2h1:2006 10h1:60037 12h 1:1000IHC-UI克隆号:CC-EGFR 1:100,兔mAb,D3881,Cad#:4267p,lot

20、#:zdp011104; Cell signaling公司3.检测系统常用检测系统：目前常用的检测系统为HRP为主，主要为两类：SP、ABC、SABC等；以聚合物（Polymer）HRP检测系统，如：MaxVi、Elivi、EnVi,UIP等。已成为免疫组化的常规检测系统4.显色系统由于通常采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）或AEC（红色）作为酶底物显色。若采用的是碱性磷酸酶检测系统则选择BCLP/NBT（蓝紫色）作为酶底物显色。5.滴加抗体抗体的滴加量一般为2-3滴，可视组织大小酌情增减。加抗体之前，应用吸水纸抹去玻片多余水分，或用手稍甩玻片，防止抗体稀释。之前用含Tn20的PB

21、S浸泡的玻片，防水圈会稍慢些，可等防水圈完整后再加抗，抗体孵育完成后，特别是一抗，应单张蒸馏水冲洗，防止抗体交叉污染。6.PBS冲洗PBS除能纠正组织的持抗原抗体反应环境之外，还能维加入Tn20的PBS，抗体更能平顺的覆盖组织表面浸泡前，检查PBS是否呈乳白色，或有絮状沉淀，否则会加深染色背景玻片是否经过含有TPBSn 20的含量0.05-0.17. 复染复染只需苏木精浅淡的染色,过深染色覆盖已有的阳性染色过浅与DAB显色对照效果减弱避免过重的复染导致结果判读复染5min一抗浓度：即用型,1:1稀释复染10min复染5min一抗浓度：即用型,1:1稀释复染10min总结必须设置对照免疫组化的影

22、响很多，都解决起来也很难。但是，有一个简单的解决办法，几乎可以将所有的技术问题都解决，这就是：设立对照阳性对照染色成功，说明技术过程没有问题；反之，肯定有问题，需要找原因，进行改进。阳性对照自身对照（对照）理想的对照，测试条件相同，结果更可靠更具有可比性。外部对照1、多组织切片2、“腊肠”“春卷”切片3、组织4、阑尾监测对照如对照试验结果出现意外应该次试验并重做（不分析结果）高级应定期抽验曾使用过的对照样品，监测对照样品质量89对照的种类“切片上”的外部和的组织对照的说明。这是正确的做法尽可能包括细胞（或组织单元），将作为对照（预计将无效）当选择组织 设置对照的现状没有设置任何对照，也不关注有

23、无内对照没有设置外对照，但关注内对照的情况设置外部对照，不设置设置外部对照，也设置试剂对照试剂对照所有对照都是每个有无可比性？自己设置的国际标准：阳性对照没有完美的标准每个的对照都不尽相同共识：代表目前国际认知水平 标准国际标准的免疫组化(dIHC)对照设置及意义：国际组的建议Standardizat of Negative Controlsgnostic s From theImmunohistochemistry:mendaternatal Ad Hoc Expert PanelEmina E. Torlakovic, MD,D,* Glenn Francis, M, FRCPA,MBAm

24、, FFSc (RCPA), John Garratt, RT,# Blake Gilks, MD,FRCPC,* Elizabeth Hyjek, MD,D,* Merdol Ibrahim,D,Rodney Miller, MD, Sren Nielsen, HT,CT, Eugen B. Petcu, MD,D, Paul E. Swanson,MD, Clive R. Taylor, MD, MDD,# and Mogens Vyberg,April2014 ;22(4): 241252国际标准的免疫组化(dIHC)阳性对照设置及意义：国际组的建议From the *Departmen

25、t of Laboratory Hematology, Toronto General Hospital, University Health Network, University of Toronto, Toronto, ON;*Vancouver Costal Health; wwVancouver General Hospitaiversity of British Columbia, Vancouver, BC;#Department of Pathology, University of Calgary, Calgary, AB, Canada;wCanadian Immunohi

26、stochemistry Quality Control (CIQC), Vancouver, BC, Canada;zInstitute of Pathology, Aalb Aalb, Denmark;University Hospital, Denmark; yNordic Immunohistochemistry Quality Control (NordiQC),8Griffitiversity School of Medicine, Gold Coast Cus;zAustralian Institute for Bioengineering and Nano-Technology

27、, University of Queensland, Qld, Australia;#Convenor Immunohistochemistry, Anatomical Pathology Program, RCPA QAP Pty zzBeth Israel Deaconess Medical Center;., Sydney, Australia;yyBrigham and Womens Hospital, Harvard medical School,ton, MA;88UK Natal External Quality Assessment Scheme (UK NEQAS), Un

28、iversity College London, London, UK;zzUniversity of Washington, Seattle, WA;*Department of Pathology, Beijing Friendshiospital, Capital Medicaiversity, Beijing, China;wwwChiCommittee for Pathology-Immunohistochemistry Quality Control (-IHCQC); andzzzKeck School of Medicine, University of Southern Ca

29、lifornia, Los Angeles, CA.北欧免疫组化质量控制（NordiQC）；病理学院外部质量保证/水平测试（CQA/PT）；免疫组化质量控制（CIQC）；澳大利亚病理学院（RCPAQAP）；免疫组化设备FDA分类;中国PQCC、。对照设置的意义免疫组化标准化的实现是个浩大的工程，包括标本的取材固定、试剂选择、检测程序、操作要领、设置对照、结果判读、病理技术部质量控制和每个检测和病理医生的培训、认证、内质量控制等都要有相应的执行标准，并且都应一丝不苟的执行，可以看出这个目标还需经过长时间的努力去实现。分子病理相关技术ISH:FISH CISH SISHDNA突变检测技术重排NGS

30、原位杂交理论与技术原位杂交理论原位杂交(In Situ Hybridizat;ISH)是指应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体,用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法，在核酸原位上把它显示出来。原位杂交理论与技术Sle DNAProbe DNADenatureHybridizeDirect LabelWash & DetectIndirect LabelFluorescent In Situ Hybridizat原位杂交理论与技术ISH应用软组织肿瘤滑膜肉瘤: SYT-SSX断裂；尤文肉瘤: EWS断裂；横纹肌

31、肉瘤: FKHR的断裂脂肪肉瘤 : CHOP断裂原位杂交理论与技术ISH应用少突胶质瘤: 检测1p/19q杂合性缺失对少突胶质瘤的临床治疗指导和判断预后方面有着重要意义癌:检测CSP3/CSP7;GLPp16/CSP17探针可用于辅助癌融合探针 :宫颈癌:GLP TERC/CSP3探针慢性粒细胞性白血病 BCR/ABL融合探针原位杂交理论与技术软组织肿瘤中的频发特异异常肿瘤类型异常涉及发生率(%)ES/PNETt(11;22)(q24;q12)EWS-FLI195t(21;22)(q22;q12)EWS-ERG5t(7;22)(p22;q12)EWS-ETV11t(17;22)(q12;q12

32、)t(2;22)(q33;q12)t(11;22)(p13;q12)t(2;13)(q35;p14)t(1;13)(p36;p14)der(17), t(x;17)(p11;q25) t(17;22)(q22;q13)t(X;18)(p11;q11)EWS-EIAF EWS-FEV EWS-WT1 PAX3-FKHR PAX7-FKHR ASPL-TFE3COLIA1-PDGFBSYT-SSX111100951010010065DSRCTARMSASPS DFSPsynovialat(X;18)(p11;q11)SYT-SSX235t(X;18)(p11;q11)SYT-SSX460cellw

33、ell differentiated12q13-15lificatDNA突变检测技术第二长海医院病理科突变（genemu）指上一个位点内遗传物质的变化，即DNA分子长链中DNA碱基对的置换、增添或缺失等改变而引起的结构的变化。以单碱基突变即点突变（po为常见.mu）最突变的形式有点突变、缺失、易位或重排、其他类型的突变,如、甲基化、非组蛋白改变等形式导致因激活或抑癌结构异常，致使癌基失活。一、DNA突变检测技术1. DNAPCR扩增单链构象多态性分析/限制性片段多肽性分析、或直接进行DNA来完成。2.DNA提取实时荧光定量PCR数值和分析。DNA突变检测技术-传统方法PCR-SSCP法PCR-

34、RELP法PCR-DNA法焦磷酸法实时荧光定量PCR法实时荧光定量PCR技术于1996年由AppdBiosystems公司推出。实时荧光定量 PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时荧光定量PCR法基本原理在荧光定量PCR反应体系中加入一种荧光化学物质(如SYBR Green I)，它能与双链DNA小沟部位结合，而且具有绿色激发波长。在PCR进程的和延伸阶段，该DNA双链中发出荧光，在变性阶段，由于DNA

35、双链解开，从DNA分子上游离下来而不产生荧光，因此荧光信号的强弱与双链DNA的量成正比。实时荧光定量PCR法基本原理PCR进程中，随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强每经过一次循环，收集一次荧光信号,即到一个荧光扩增曲线，根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化。ARMS法基本原理特异性PCR + 荧光探针= ARMS方法等位突变正向引物产生荧光信号延伸A突变DNA模板反向引物突变正向引物无延伸G野生DNA模板反向引物ARMS法操作流程及数据解读实时定量 PCR数据分析DNAARMS反应组织标本标本 1（突变阳性）标本 2突变信号(FAM)（突变）内参信号(HEX)内参信号(HEX)突变信号:

36、内参信号:+-+重排检测方法用于重排检测的方法主要有两种1Southernblot杂交法2多聚酶链反应扩增技术(PCR)Southernblot杂交法1981年Korsmeyer等首先用SouthernBlot方法进行重排检测大部分病例应用IgH和TCR探针就能明确，若不明确，可再用Ig探针检测，其它IgTCRTCRTCR不用于克隆性检测Southernblot杂交法原理：两条单链DNA碱基可与人工的互补单链DNA探针相结合，探针一般用同位素标记。将细胞DNA抽提出来，用限制性内切酶进行酶切,以IgH或TCR基因保守序列互补的cDNA为探针进行膜上杂交，放射自显影显示酶切片段正常或多克隆性的淋

37、巴细胞增生时，重排片段大小各异而显示弥散带若有一定数量单克隆性增殖的淋巴细胞存在（1-5%）则会出现特异性条带Southernblot杂交法优点缺点敏感度高，可靠性好，被视为 “金标准”判断是否为单克隆性细胞增生判断肿瘤细胞的来源检测肿瘤细胞的残留和复发需要较大量的新鲜组织或冰冻组织(10ug)操作复杂，时间过长需使用放射性同位素标记、易污染，成本高仅适用于科研不适于临床Southernblot杂交法聚合酶链反应扩增法（PCR）PCR方法由Mullis等于1985年设计成功，1989年开始用于淋巴瘤的原理：Ig和TCRV-D-J区序列具有高度细胞克隆特异性，不同克隆来源的B和T细胞V-D-J区

38、碱基序列各异，发生重排后的V-D-J区彼此靠近，用适当的引物可以将重排片段扩增聚合酶链反应扩增法（PCR）多克隆性增生:PCR则产生大小不同、序列各异的片段，电泳克隆性条带或弥散状单克隆增殖的:所有细胞只有同一形式基因重排，其重排片段大小相同，PCR产物大小一致，序列相同，经PCR扩增后电泳呈专一性窄带聚合酶链反应扩增法（PCR）一般采用普通PCR和引物检测某一类型Ig和TCR的重排情况，如选取Ig与TCR的V、D、J、C区编码20个左右的保守核苷酸序列人工一对或多对引物，与待测的模板DNA单链碱基互补，扩增目的DN段淋巴瘤扩增产物电泳出现单克隆性单带，淋巴组织良性增生性则出现弥散状PCR扩增法优点缺点快速、简便、敏感、经济实用新鲜、冰冻、石蜡包埋组织和穿刺细胞标本均可避免放射性危害，易于常规开展影响多稳定性欠佳影响稳定性的：样本DNA质量、浓度引物的质量、浓度 PCR反应体系DNA聚合酶的活性退火温度目前IgHTCR 和TCR和重排较成功淋巴细胞重排的意义提倡：将传统的临床、形态学、免疫组化与分子遗传学方法结合起来遇