微生物学检验基本技术1

1、.：.；微生物学检验根本技术1微生物学检验根本技术 随着现代医学及相关科学技术的开展，各学科相互交叉和浸透，医学微生物学检验技术已深化到细胞、分子和基因程度，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛运用。医学微生物学实验室的根本义务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进展耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研讨等提供科学根据。 第一节微生物形状学检查细菌形状学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的根底，可根据其形状、构造和染色反响性等，为进一步鉴定提供参考根据。 一、显微镜检查 由于细菌个体微小，肉眼不能

2、看到，必需借助显微镜的放大才干看到。普通形状和构造可用光学显微镜察看，其内部的超微构造那么需用电子显微镜才干看清楚。常用显微镜有如下几种。 1普通光学显微镜 采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4m。显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2m，而肉眼可见的最小笼统为0.2mm。故用油浸镜放大1 000倍，能将0.2m的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的察看。 2暗视野显微镜 常用于察看不染色微生物形状和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下察看到光亮的微生

3、物如细菌或螺旋体等。 3相差显微镜 相差显微镜利用相差板的光珊作用，改动直射光的光位相和振幅，将光相的差别转换为光强度差。在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差别，可察看到微生物形状、内部构造和运动方式等。 4荧光显微镜 荧光显微镜与普通光学显微镜根本一样，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数运用的是落射光安装，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用普透明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。 5电

4、子显微镜 用电子流作为光源，波长与可见光相比差几万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或几十万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微构造的察看。 二、不染色标本检查 不染色标本普通可用于察看细菌形状、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进展察看。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌那么呈不规那么布朗运动。梅毒惨白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形状和运动方式，具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。 1悬滴法 在干净凹玻片的凹孔周围涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹玻片的

5、凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封锁后置高倍镜下或暗视野察看。 2压滴法 用接种环取一环菌悬液置于干净玻片的中央，在菌悬液上悄然盖上一盖玻片，留意防止产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒钟后置高倍镜下明视野或暗视野察看。 3毛细管法 主要用于厌养菌动力的检查。通常选用6070mm长。0.51.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野察看。 三、染色标本检查 细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上构成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地察看到细菌的形状特征如细菌的大小

6、、外形、陈列等和某些特殊构造如荚膜、鞭毛、芽孢等，并可根据染色反响性对细菌加以分类鉴定。 一细菌染色的普通程序 细菌染色的普通程序是：涂片枯燥固定染色媒染脱色复染。 1涂片制备 血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培育物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变部分涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培育基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培育物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然枯燥或远火渐渐烘干。 2固定 目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及构造，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，防止在水洗过程中被水冲掉；改动细菌对染料的通透

7、性，有利于菌细胞内构造的染色。通常用火焰加热固定，将已枯燥的涂片在火焰中迅速经过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。 3染色 根据检验目的不同，选择不同的染色方法进展染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。 4媒染 凡能加强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改动的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。 5脱色 凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。 6复染 已脱色处置的细菌或其

8、构造常以复染液作复染以便于察看。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。 二常用染色法染液配方见第8章 1 单染色法 只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可察看细菌的大小、形状与陈列，不能显示细菌的构造与染色特性。 2复染色法 用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可察看细菌的大小、形状与陈列外，还反响出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。 1革兰染色：细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。加碘液媒染 1min，

9、水洗，甩干。用95%乙醇脱色，悄然摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进展复染，约30s，水洗。干后显微镜下镜检察看结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。 2抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。继续染5min奴卡菌需求加长时间，水洗，甩干。滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色零落为止，水洗，甩干。加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。干后显微镜下镜检察看结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。 金胺O-罗

10、丹明B染色法：细菌涂片固定后加第1液3090s。弃去第1液后加第2液染15min。用第3液脱色12min，水洗。滴加第4液染30s，水洗，干后置荧光显微镜下镜检察看结果 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。 3特殊染色法 1鞭毛染色改良Ryu法：玻片的处置 将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。在玻片上滴蒸馏水1滴。挑取培育物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛零落。置35孵箱自然枯燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染12 min悄然水洗。干后显微镜镜检察看结果 鞭毛和菌体呈紫色。 2异染颗粒染色(阿尔培托法)：细菌涂片经火焰

11、固定，加甲液染色35min。水洗。滴加乙液，染1min。水洗。干后显微镜镜检察看结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。 3荚膜染色：奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，继续3min，冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然枯燥，乙醇固定。滴加第一液，微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水纸吸干镜检。结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或

12、不着色。 4芽胞染色：染液：第一液为萋纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为碱性美蓝液。方法：将已固定的细菌涂片滴加第一液，微加热染5min，冷却后水洗。用第二液脱色2min，水洗。加第三液复染1min，水洗，待干镜检。结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。 4负染色法 背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。最常见的是墨汁负染色法，用来察看真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片(勿产生气泡)，轻压。在低倍镜下寻觅有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。 5荧光染色法 经荧光素染色的细菌，或荧光素标志的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结

13、合构成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。 第二节 微生物培育与分别方法 大多数细菌均可以经过人工方法培育，而衣原体和病毒的分别培育往往需求活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只需将微生物培育出来才干对它进展研讨、鉴定和运用。 一、接种与分别方法 根据待检标本的性质、培育目的和所用培育基的种类，采用不同的接种方法。 1平板划线分别培育法 对混有多种细菌的临床标本，采用划线分别和培育，使原来混杂在一同的细菌沿划线在琼脂平板外表分别，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需求借助琼脂平板划线分别目的菌。平板划线分别法通常有两种方法： 1分区划

14、线分别法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分别。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区占培育基总面积的1/4并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接13次。一个胜利分区划线的平板，培育后分别察看1区构成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分别到单个菌落。 2延续划线分别法：此法常用于含菌量不多的标本或培育物中的细菌分别培育。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处悄然涂抹，然后再用接种环或拭子在平板外表曲线延续划线接种，直至划满琼脂平板外表。 2 琼脂斜面接种法 主要用于菌

15、落的移种，以获得纯种进展鉴定和保管菌种等。用接种环针挑取单个菌落或培育物，从培育基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折延续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培育基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。 3穿刺接种法 此法多用于半固体培育基或双糖铁、明胶等具有高层的培育基接种，半固体培育基的穿刺接种可用于察看细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培育基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培育基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。 4液体培育基接种法 用于各种液体

16、培育基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培育管，在液面与管壁交界处研磨接种物以试管直立后液体淹没接种物为准。此接种法应防止接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免构成气溶胶，呵斥实验室污染。 5倾注平板法 本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培育物的稀释或原标本1ml至无菌培育皿内，再将已融化并冷却至4550左右的琼脂培育基1520ml倾注入该无菌培育皿内，混匀，待凝固后置37培育，长出菌落后进展菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格每格为1cm2中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按以下公式计数，求

17、出每毫升标本中的细菌数。 全平板菌落数=每方格的平均菌落数r2 每ml标本中的细菌数=全平板菌落数稀释倍数 6涂布接种法 本法多用于纸片分散法药敏实验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培育基外表，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂外表，然后贴上药敏纸片，或直接培育，本法经培育后细菌构成菌苔。 二、细菌的培育方法 根据不同的标本及不同的培育目的，可选用不同的培育方法。通常把细菌的培育方法分为需氧培育、二氧化碳培育、微需氧培育和厌氧培育四种。 1需氧培育 是指需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培育，将已接种好的平板、斜面、液体培育基等在空气中置35孵育

18、箱内孵育1824h，无特殊要求的细菌均可生长。少数生长缓慢的细菌需求培育3-7d甚至1个月才干生长。为使孵育箱内坚持一定的湿度，可在其内放置一杯水。对培育时间较长的培育基，接种后应将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡-凡士林封固，以防培育基干裂。 2二氧化碳培育 某些细菌，如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、布鲁氏菌和流感嗜血杆菌等的培育，特别是在初次分别时，须在5%10 %二氧化碳环境中培育才干生长。常用的培育法如下。 1二氧化碳培育箱法：二氧化碳孵箱能自动调理二氧化碳的含量、温度和湿度，培育物置于孵育箱内阁，孵育一定时间后可直接察看生长结果。 2烛缸培育法：取有盖磨口标本缸或玻璃枯燥器，将

19、接种好的培育基放入缸内，点燃蜡烛后放在缸内稍高于培育物的位置上，缸盖或缸口均涂以凡士林，加盖密闭。因缸内蜡烛熄灭氧逐渐减少，数分钟后蜡烛自行熄灭，此时容器内二氧化碳含量约占5%10%。将缸置于35普通孵育箱内孵育。 3气袋法：选用无毒透明的塑料袋，将已接种标本的培育皿放入袋内，尽量祛除袋内空气后将开口处折叠并用弹簧夹夹紧袋口。使袋呈密闭形状，执断袋内已置的二氧化碳产气管安瓿产生二氧化碳，数分钟内就可到达需求的二氧化碳培育环境，置于35孵育箱内孵育。 4化学法：常用碳酸氢钠-盐酸法。按每升容积称取碳酸氢钠0.4g与浓盐酸0.35ml比例，分别置容器内，连同容器置于玻璃缸内，盖严密封，倾斜缸位使盐

20、酸与碳酸氢钠接触而生成二氧化碳。于35孵育箱内孵育。 3微需氧培育 微需氧菌培育在大气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含有5%-6% 氧气，5%-10%二氧化碳和85%氮气的气体环境中才可生长，将标本接种到培育基上，置于上述气体环境中，35进展培育即微需氧培育法。 4厌氧培育 厌氧菌对氧敏感，培育过程中需呵斥低氧化复原电势的厌氧环境。厌氧培育常用的方法有：物理法、化学法、生物法。如厌氧罐培育法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生厌氧法等。 三、细菌在培育基上生长特性 1固体培育基 标本或液体培育物划线接种到固体培育基外表后，单个细菌经分裂繁衍可构成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落colony。

21、(1)菌落的形状特征：大小、外形露滴状、圆形、菜花样、不规那么等、突起或扁平、凹陷、边缘光滑、波形、锯齿状、卷发状等、颜色红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等、外表光滑、粗糙等、透明度不透明、半透明、透明等和粘度等。据细菌菌落外表特征不同，可将菌落分为3型： 光滑型菌落S型菌落：菌落外表光滑、潮湿、边缘整齐，新分别的细菌大多呈光滑型菌落。粗糙型菌落R型菌落：菌落外表粗糙、枯燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体外表多糖或蛋白质构成。R型细菌抗原不完好，毒力和抗吞噬才干都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分别的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。粘液型菌落M型

22、菌落：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。 (2)菌落溶血特征：菌落溶血有以下3种情况。溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培育基出现12mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；溶血：又称完全溶血，菌落周围构成一个完全明晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周围的培育基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。 (3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培育基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。 (4)气味：某些细菌在培育基中生长繁衍后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌生姜气味、变形杆菌巧克力烧焦的臭

23、味、厌氧梭菌*的恶臭味、白色假丝酵母菌酵母味和放线菌泥土味等。 2液体培育基 细菌在液体培育基中有3种生长景象：大多数细菌在液体培育基生长繁衍后呈均匀混浊；少数链状陈列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等那么呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌普通呈外表生长，常构成菌膜。 3半固体培育基 半固体培育基主要用于细菌动力实验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培育基依然廓清透明，为动力实验阴性。 第三节 细菌的生物化学实验 各种细菌具有各自独特的酶系统，因此对底物的分解才干不同，其代

24、谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学实验或称生化反响。生物化学实验的方法很多，主要有以下几类。 一、碳水化合物的代谢实验 1糖醇、苷类发酵实验 1原理：不同种类细菌含有发酵不同糖醇、苷类的酶，因此对各种糖醇、苷类的代谢才干也有所不同，即使能分解某种糖醇、苷类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培育基中所含糖醇、苷降解后产酸或产酸产气的才干，可用以鉴定细菌种类。 (2)方法：在根底培育基中如酚红肉汤根底培育基pH7.4参与0.51.0w/v的特定糖醇、苷类。所运用的糖醇、苷类有很多种，根据不同需求可选择单糖、

25、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培育细菌接种入实验培育基中，置35孵育箱内孵育数小时到两周视方法及菌种而定后，察看结果。假设用微量发酵管，或要求培育时间较长时，应留意坚持其周围的湿度，以免培育基枯燥。 (3)结果：能分解糖醇、苷产酸的细菌，培育基中的指示剂呈酸性反响如酚红变为黄色，产气的细菌可在小倒管Durham小管中产生气泡，固体培育基那么产生裂隙。不分解糖那么无变化。 (4)运用：糖醇、苷类发酵实验，是鉴定细菌的生化反响实验中最主要的实验，不同细菌可发酵 不同的糖醇、苷类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌那么可发酵葡萄糖和乳糖。即使是两种细菌均可发

26、酵同一种糖类，其发酵结果也不尽一样，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者那么产酸、产气，故可利用此实验鉴别细菌。 表6-4-1 常用于细菌糖发酵实验的糖、醇类 单糖 四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖 双糖 蔗糖葡萄糖果糖 乳糖葡萄糖半乳糖 麦芽糖两分子葡萄糖 三糖 棉子糖葡萄糖果糖半乳糖 多糖 菊糖多分子果糖 淀粉 醇类 侧金盏花醇 卫茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖类 肌醇 2葡萄糖代谢类型鉴别实验 (1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有分子氧参与的，称为氧化型；能进展无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为

27、产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中那么不能分解葡萄糖。本实验又称氧化发酵O/F或HughLeifson，HL实验，可用于区别细菌的代谢类型。 (2)方法：挑取少许纯培育物不要从选择性平板中挑取接种2支HL培育管中，在其中一管参与高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气作为密封管，另一管不加作为开放管。置35孵箱孵育48h以上。 (3)结果： 两管培育基均不产酸颜色不变为阴性；两管都产酸变黄为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。 (4)运用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或

28、产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌发酵型与微球菌氧化型。 3甲基红MR实验 (1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培育基pH下降至4.5以下时，参与甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质如醇、醛、酮、气体和水，培育基pH在 5.4以上，参与甲基红指示剂呈桔黄色。 (2)方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35孵育48h96h后，于5ml培育基中滴加56滴甲基红指示剂，立刻察看结果。 (3)结果断定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。 (4)运用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，

29、如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。 4半乳糖苷酶实验ONPG实验 (1)原理：乳糖发酵过程中需求乳糖通透酶和半乳糖苷酶才干快速分解。有些细菌只需半乳糖苷酶，因此只能缓慢发酵乳糖，一切乳糖快速发酵和缓慢发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-D-半乳糖苷O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。 (2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35水浴或孵箱孵育1824h，察看结果。 (3)结果：呈现亮黄色为

30、阳性，无色为阴性。 (4)运用：可用于缓慢发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及缓慢分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为实验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。 5VP实验 (1)原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的才干。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧构成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培育基中的精氨酸等含胍基的物质结合构成红色化合物。即V-P实验阳性。 (2)方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35孵育2448h，参与50g/L萘酚95乙

31、醇溶液0.6ml，悄然振摇试管，然后加0.2ml 400g/L KOH，悄然振摇试管30s至1min，然后静置察看结果。 (3)结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。 (4)运用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本实验常与MR实验一同运用，普通情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇特变形杆菌的VP实验和MR实验常同为阳性。 6胆汁七叶苷水解实验 1原理：在10%40胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的才干。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培育基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反响构成黑色化合物。 (2)方法：将被检菌接种于

32、胆汁七叶苷培育基中，35孵育1824h后，察看结果。 (3)结果：培育基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。 (4)运用：主要用于鉴别D群链球菌与其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌如脆弱拟杆菌等的初步鉴别。D群链球菌本实验为阳性。 7淀粉水解实验 (1)原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培育基上滴加碘液时，可在菌落周围出现透明区。 (2)方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35孵育1824h，参与革兰碘液数滴，立刻察看结果。 (3)结果：阳性反响，菌落周围有无色透明区，其它地方蓝色；阴性反响，培育基全部为蓝色。 (4)运用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水

33、解实验阳性，轻、中型阴性；芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。 8甘油复红实验 (1)原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，呈深紫红色。 (2)方法：取被检菌接种于甘油复红肉汤培育基中，于35孵育，察看28d。应同时做阴性对照。 (3)结果：紫红色为阳性，与对看管颜色一样为阴性。 (4)运用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。伤寒沙门菌、甲丙型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本实验为阴性， 乙型副伤寒沙门菌结果不定，其它不常见沙门菌多数为阳性。 9葡萄糖酸氧化实验 (1)原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成-酮基葡萄糖酸。-

34、酮基葡萄糖酸是一种复原性物质，可与班氏试剂起反响，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。 (2)方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培育基中(1ml)，置35孵育48h,参与班氏试剂1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷却，察看结果。 (3)结果：出现黄到砖红色沉淀为阳性。不变或仍为蓝色为阴性。 (4)运用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。 二、氨基酸和蛋白质的代谢实验 1硫化氢实验 (1)原理：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，与亚铁离子或铅离子结合构成黑色沉淀物。 (2)方法：将待检菌接种于含硫化物及亚铁离子的培育基或克氏双糖铁琼脂KIA中，35孵育1824h，察看有无黑色沉淀出现。或用醋酸

35、铅纸 条，悬挂于KIA管中白色滤纸，根据试管大小裁剪适当，在热的50g/L醋酸铅饱和水溶液中浸泡，然后于5060烘干，12115min高压灭菌备用。醋酸铅是最敏感的方法。 (3)结果：有黑色沉淀物为阳性。 (4)运用：主要用于鉴别肠杆菌科细菌，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。 2明胶液化实验 (1)原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶明胶酶能分解明胶，使明胶失去凝固才干而液化。 (2)方法：将待检菌接种于明胶培育基中，35孵育24h到7d或更长时间，每24h取出放入4冰箱约2h后，察

36、看有无凝固。 (3)结果：如无凝固，那么表示明胶已被水解，液化实验阳性。如凝固，那么继续培育。 (4)运用：奇特变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化。 3吲哚实验靛基质实验 (1)原理：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对二甲氨基苯甲醛构成红色的玫瑰吲哚。 (2)方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培育基中，35孵育2448h，参与靛基质试剂，察看结果。 (3)结果：红色为阳性，无色为阴性。 (4)运用：主要用于肠杆菌科细菌

37、的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。 4苯丙氨酸脱氨酶实验 (1)原理：测定细菌能否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，参与三氯化铁试剂后产生绿色反响。假设延伸时间，会引起退色。 (2)方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培育基中，35孵育1824h，滴加100g/L三氯化铁试剂45滴，立刻察看菌落生优点有无绿色出现。 (3)结果：有绿色出现为阳性。 (4)运用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。 5氨基酸脱羧酶实验 (1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。由于胺

38、的生成使培育基变为碱性，可用指示剂指示出来。 (2)方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸脱羧酶实验管和1支氨基酸脱羧酶对看管无氨基酸，各覆盖至少0.5cm高度 的无菌石蜡油，35孵育14d，察看结果。 (3)结果：假设为溴甲酚紫指示剂，那么实验管紫色为阳性，黄色为阴性，对看管应为黄色。 (4)运用：主要用于某些细菌种间的鉴别，如赖氨酸用于产气肠杆菌阳性与阴沟肠杆菌阴性；鸟氨酸用于阴沟肠杆菌阳性和克雷伯菌阴性；精氨酸用于阴沟肠杆菌阳性和产气肠杆菌阴性等。 6精氨酸双水解酶实验 (1)原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺

39、均为碱性物质，故可使培育基变碱，用 指示剂指示出来。 (2) 方法：将待检菌接种于实验培育上，置35孵箱孵育14d，察看结果。 (3) 结果：溴甲酚紫指示剂呈紫色为阳性，酚红指示剂呈红色为阳性。黄色为阴性。 (4) 运用：主要用于肠杆菌科及假单胞菌属的鉴定。 7尿素酶实验 (1)原理：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培育基变碱。 (2)方法：将待检菌接种于含有尿素的培育基中，35孵育1824h，察看结果。 (3)结果：红色为阳性，不变为阴性。 (4)运用：主要用于肠杆菌科变形杆菌属、普罗威登菌属、克雷伯菌属及假单胞菌属的鉴定。 8霍乱红实验 (1)原理：霍乱弧菌分解色氨酸生成吲哚

40、，并能使硝酸盐复原为亚硝酸盐，当参与硫酸后生成亚硝酸吲哚，呈红色反响。 (2)方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，置35孵育24h，参与浓硫酸数滴，察看结果。 (3)结果：呈红色者为阳性。 (4)运用：霍乱弧菌呈阳性反响，但本实验并非霍乱弧菌所特有。凡能产生吲哚并复原硝酸盐为亚硝酸盐的细菌，均可呈现阳性反响。 三、碳源和氮源利用实验 1枸橼酸盐利用实验 (1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为独一碳源，而在此培育基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培育基变碱性。 (2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培育基上，置35孵育14d，逐日察看结果。 (3)结果：假设用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，

41、培育基变蓝色为阳性；无菌落生长，培育基绿色为阴性。 (4)运用：可用此实验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸橼酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。 2丙二酸盐利用实验 (1)原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为独一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培育基变碱。 (2)方法：将待检菌接种于丙二酸盐培育基中，置35孵育2448h，察看结果。 (3)结果：培育基由绿色变为蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。 (4)运用：肠杆菌科中亚利桑那菌和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆

42、菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反响，其它各菌属均为阴性。 3醋酸钠利用实验 (1)原理：细菌利用铵盐作为独一氮源，同时，利用醋酸盐作为独一碳源时，可在醋酸盐培育上生长，分解醋酸盐生成碳酸钠，使培育基变为碱性。 (2)方法：将被检菌接种于醋酸盐培育基中，置35孵育27d，逐日察看结果。 (3)结果：培育基上有细菌生长，并变为蓝色为阳性。 (4) 运用：主要用于大肠埃希菌和志贺菌属的鉴别，前者为阳性，而后者为阴性。 4马尿酸钠水解实验 (1)原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，构成苯甲酸铁沉淀。 (2)方法：将待检菌接种于马尿酸钠培

43、育基中，置35孵育48h，离心沉淀，取上清液0.8ml，参与三氯化铁试剂0.2ml，立刻混匀，经1015min察看 结果。 (3)结果：出现恒定之沉淀物为阳性。 (4) 运用：主要用于B群链球菌的鉴定。 5、乙酰胺利用实验 (1)原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培育基变碱。 (2)方法：将被检菌接种于乙酰胺培育基中，置35孵育2448h，察看结果。 (3)结果：培育基由绿色变为蓝色为阳性。如不生长，或稍有生长，但培育基颜色不变为阴性。 (4)运用：主要用于非发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、去硝化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳性，其它非发酵菌大多数为阴性。 四、酶类实

44、验 1.氧化酶实验 (1)原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反响，而是先使细胞色素C氧化，然后 此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反响。因此，本实验结果与细胞色素C的存在有关。 (2)方法：取干净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液1滴，1min内察看结果。也可将试剂滴加到菌落上进展实验。 (3)结果：阳性者立刻变粉红色，510s内呈深紫色。无色为阴性。 (4)运用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性

45、，而后者阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。 本卷须知： 实验时应防止接触含铁物质，以免出现假阳性。10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常改换新试剂，并盛于棕色瓶中，假设试剂已变成深蓝色，应弃去不用。 2触酶实验 (1)原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而构成氧分子，出现气泡。 (2)方法：取干净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3H2O2 1滴，立刻察看结果。 (3)结果：假设立刻出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。 (4)运用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴

46、性，故常用此实验来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别那么用耐热触酶实验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。 本卷须知：3H2O2溶液要新颖配制。不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反响，取对数生长期的细菌。 3凝固酶实验 (1)原理：凝固酶实验是鉴定葡萄球菌致病性的重要实验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使发生沉淀，包围于细菌外面而凝聚成块，玻片法阳性结果是由此凝聚因子所致；另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原

47、变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶。 (2)方法: 玻片法：在一张干净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培育物与其混合设阳性和阴性对照制成菌悬液，假设经1020s内无自凝 景象发生，那么参与人或兔新颖血浆1环，与菌悬液混合，察看结果。试管法：于试管内加14稀释的兔或人血浆0.5ml，再加12个待试菌菌落，置37水浴，每30min察看1次结果。 (3)结果：玻片法：510s内出现凝集者为阳性。试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。2h后无上述景象出现，那么放置过夜后再察看。 (4)运用：本实验仅用于致病性葡萄球的鉴定。 本卷须知：玻片法为挑选实验，阳性、阴性均

48、需进展试管法测定。血浆必需新颖。应运用肝素而非枸橼酸盐作抗凝剂抗凝的血浆。本实验也可用市购的胶乳凝集实验试剂盒测定。 4DNA酶实验 (1)原理： 某些细菌能产生DNA酶，水解外源性DNA使之成为寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸那么不会。故在DNA琼脂平板上加盐酸后，可在 菌落周围构成透明区。 (2)方法：在DNA琼脂平板上点种待检菌，35孵育1824h，用1 mol/L盐酸倾注平板，察看结果。 (3)结果：如菌落周围有透明区者为阳性，无透明区为阴性。 (4)运用：主要用于肠杆菌科及葡萄球菌属某些菌种的鉴定。沙雷菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌DNA酶均阳性。 5胆汁溶菌实验 (1)原理：胆

49、汁或去氧胆酸钠能导致某些细菌溶解，一方面是由于胆汁或去氧胆酸钠降低了细菌细胞膜上的外表张力，使细菌的细胞膜破损或使菌体裂 解。另一方面能够与激活细菌体内的自溶酶有关。 (2)方法：试管法：用纯培育物制备1ml生理盐水浓菌悬液，pH调至7.0，分装两支试管，各0.5ml。其中一管加0.5ml 100g/L去氧胆酸钠为实验 管，另一管加0.5ml生理盐水作对照。35孵育每小时察看1次结果。平板法：在血平板上选取单个可疑菌落，作好标志，直接在菌落上加1接种环20g/L去氧胆酸钠pH7.0，置35孵育30min平板不要翻转察看结果。 (3)结果：试管法：在3h内液体透明为阳性。平板法：如菌落消逝，仅留

50、下溶血区为阳性，菌落不消逝为阴性。 (4)运用：用于肺炎链球菌的鉴定。 6硝酸盐复原实验 (1)原理：硝酸盐复原反响包括两个过程，其一是在合成代谢过程中，硝酸盐复原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；另一是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐替代氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐复原过程可因细菌不同而异。有的细菌仅使硝酸盐复原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等；有的细菌可使其复原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐复原为氮，如沙雷菌属；有的细菌还可以将其复原产物在合成性代谢中完全利用。硝酸盐或亚硝酸盐假设复原生成气体的终末产物如氮或氧化氮，那么称为脱硝化或脱氮化

51、作用。某些细菌能复原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与-萘胺结合生成N-萘胺偶苯磺酸。 (2)方法：将待检菌接种于硝酸盐培育基内含小倒管中，35孵育14d。将甲、乙等量混合液用时混合0.1ml加于试管内，立刻或10min内察看结果。 (3)结果：出现红色为阳性反响。如欲察看有无氮气产生，可于培育基管内加1只小倒管，有气泡产生，那么表示有氮气生成。如欲检查培育基中硝酸盐能否被分解，可取锌粉少许参与培育基内，如出现红色阐明硝酸盐仍存在；假设不出现红色，表示硝酸盐已被分解。 (4)运用：本实验广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌均能复

52、原硝酸盐为亚硝酸盐；假单胞菌属中有的细菌能产生氮气，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、斯氏假单胞菌，有的那么能复原硝酸盐为亚硝酸盐，如鼻疽假单胞菌等；厌氧菌如韦荣菌也能复原硝酸盐为亚硝酸盐。 7卵磷脂酶实验 (1)原理：细菌产生的卵磷脂酶，经钙离子作用，能迅速分解卵黄或血清中的卵磷脂构成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。 (2)方法：取待检菌划线接种或点种在卵黄琼脂平板上，置35孵育36h，察看结果。 (3)结果：3h后在菌落周围构成乳白色混浊，即为卵磷脂酶实验阳性，6h后该混浊圈可扩展到直径56mm。 (4) 运用：该实验主要用于厌氧的鉴定。产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。蜡

53、样芽孢杆菌亦为阳性。 8磷酸酶实验 (1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使单磷脂水解，其反响可根据反响基质不同而异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放酚酞，在碱性环境中呈红色。 (2)方法：取待检菌接种于磷酸酚酞琼脂平板上，置35孵育1824h，于平皿盖内加1滴浓氨水，熏蒸片刻，察看结果。亦可用液体培育基，经孵育后，向管内加400g/L氢氧化钠溶液1滴，察看结果。 (3)结果：菌落变为红色者为阳性。 (4)运用：主要用于致病性葡萄球菌与非致病性葡萄球菌的鉴别，前者为阳性，后者为阴性。 9脂酶实验 (1)原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。在培育基中参与维多利亚蓝可与脂肪结合成为

54、无色化合物，假设脂肪被分解，那么维多利亚蓝释出，呈蓝色。 (2)方法：将待检菌接种于含维多利亚蓝的脂酶培育基中，置35孵育24h，察看结果。 (3)结果：培育基变为深蓝色者为阳性，否那么可呈无色或粉红色。 (4)运用：主要用于厌氧菌鉴定。在拟杆菌中产黑色素拟杆菌中间亚种产生脂酶，其它拟杆菌阴性；在梭菌属中诺维梭菌和产芽胞梭菌也产生此酶，其它梭菌为阴性。 10CAMP实验 (1)原理：B群链球菌无乳链球菌产生一种“CAMP因子，此种物质能促进葡萄球菌的-溶血素的活性。因此，可在两种细菌的交界处溶血力加强，出现箭头型透明溶血区。 (2)方法：在羊血或马血琼脂平板上，先以-溶血的金黄色葡萄球菌划一横

55、线接种。再将待检菌与前一划线作垂直接种，两者应相距1cm，于35孵育1824h，察看结果。每次实验应做阴阳性对照。 (3)结果：两种细菌划线交接处出现箭头型溶血区为阳性。 (4)运用：主要用于B群链球菌阳性的鉴定，其他链球菌均为阴性。 11石蕊牛乳实验 (1)原理：由于牛乳内含有丰富的蛋白质和糖类，各种细菌对这些物质的分解才干不同，故可有数种不同反响，用以鉴别细菌。 (2)将待检菌接种于石蕊牛乳培育基中，假设为芽胞梭菌，要在培育基中参与无菌铁末，置35孵育1824h，必要时可延伸至14d。察看结果。 (3)结果：产酸：发酵乳糖产酸，使指示剂变为粉红色。产气：发酵乳糖而同时产气，可冲开上面的凡士

56、林。凝固：因产酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。胨化：将凝固的酪蛋白继续水解为胨，培育基上层液体变清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。产碱：乳糖未发酵，因分解含氮物 质，生成胺及氨，培育基变碱，指示剂变为蓝色。 (4)运用：主要用于梭菌、链球菌和丙酸杆菌的鉴定。 脑脑2021-07-13 09:48五、抑菌实验 1Optochin敏感实验 (1)原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。对肺炎链球菌有特异抑制造用，其作用机制能够是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌那么无此作用。 (2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培育物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含5g奥普托欣纸片，置

57、烛缸或二氧化碳孵箱，35 孵育1824h，察看结果。 (3)结果：抑菌圈直径大于14mm为敏感，小于或等于 14mm为阴性。 (4)运用：主要用于肺炎链球菌敏感与其它链球菌耐药的鉴别。 2杆菌肽敏感实验 (1)原理：A群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。故此实验可对链球菌进展鉴别。 (2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培育物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U的杆菌肽纸片，置35 孵育1824h，察看结果。 (3) 结果：抑菌圈直径大于10mm为敏感，小于10mm为耐药。 (4)运用：主要用于A群与非A群链球菌的鉴别。从临床分别的菌株中有5%15%非

58、A群链球菌也对杆菌肽敏感，如6%的B群链球菌、7.5%的C群链球 菌和G群链球菌等。 3新生霉素敏感实验 (1)原理：金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低浓度新生霉素所抑制，表现为敏感，而腐生葡萄球菌那么表现为耐药。 (2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于M-H琼脂平板或血平板上，在平板中央贴含5g/片新生霉素诊断纸片一张，置35孵育1618h，察看结果。 (3)结果：抑菌圈直径大于16mm为敏感，小于或等于16mm为耐药。 (4)运用：主要用于葡萄球菌某些种的鉴定。 4O/129实验 (1)原理：O/1292，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而

59、气单胞菌属和假单胞菌属细菌那么耐药。 (2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10g/片及150g/片的O/129诊断纸片贴于平板上，置35孵育1824h，察看结果。 (3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。 (4)运用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌为耐药。其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。 5氰化钾实验 (1)原理：氰化钾可抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶均以铁卟啉作为辅基，氰化钾与铁卟啉结合，使这些酶失去活性，使细菌生长遭到抑制。 (2)方法：将

60、待检菌接种于氰化钾培育基中，同时接种一支不含氰化钾的对照培育基，置35孵育2448h，察看结果。 (3)结果：细菌在氰化钾培育基中生长的不受抑制为阳性，不生长抑制为阴性。 (4)运用：肠杆菌科中的沙门菌属、志贺菌属和埃希菌属细菌的生长遭到抑制，而其它各菌属的细菌均可生长。 六、其它实验 1克氏双糖铁或三糖铁琼脂培育基实验 (1)原理：克氏双糖铁(KIA)或三糖铁琼脂(TSI)培育基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的非常之一，假设细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长