CTC,ctDNA,循环miRNA相关知识整理

1、循环肿瘤细胞（CTC）CTC（循环月中瘤细胞，Circulating Tumor Cell）是存在于外周血中的各类月中瘤细 胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分CTC 在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶， 增加 恶性月中瘤患者死亡风险。通过美国食品药品监督管理局和我国国家食品药品监督 管理局批准的唯一的循环月中瘤细胞检测设备一cellSearch系统，通过上皮细胞黏 附分子标记磁珠对上皮细胞进行富集，4,6-二月米基-2-苯基呷咪阳性、CD45阴性、 细胞角蛋白和上皮细胞黏附分子阳性的细胞定义为循环月中瘤细胞。CTC检测通过捕捉检

2、测外周血中存在的CTC,检测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时 监测月中瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。恶性月中瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而月中瘤转移是导致月中瘤 患者死亡的主要原因。月中瘤细胞侵入到原发月中瘤细胞的周围组织中，进入血液和 淋巴管系统，形成循环月中瘤细胞 CTC,并转运到远端组织，再渗出，适应新的 微环境，最终播种、增殖、定植、形成转移灶。因此早期发现血液中的CTC, 对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。循环肿瘤DNA （ctDNA）人体血液循环系统中，含有不断流动的携带一定特征（包括突变，缺失，插 入，重排，拷贝数异常，甲基化等

3、）的循环 DNA,来自月中瘤基因组的DNA称为 循环月中瘤DNA,其来源于四个部分：1、坏死的月中瘤细胞；2、凋亡的月中瘤细胞； 3、循环月中瘤细胞；4、月中瘤细胞分泌的外排体。ctDNA在恶性月中瘤患者外周血 中的含量明显高于健康人，ctDNA所占比例与癌组织的大小和状态有关，可以 反映出癌组织DNA的特征，在月中瘤生长早期，患者临床表现不明显且影像学发 现较困难，ctDNA被认为可以用于检测月中瘤早期诊断，进展过程，预后判断及 个性化用药指导。循环miRNAmiRNA谱分析表明了大部分 miRNA分子在不同病理生理状况下呈特征性 表达.并能在体液中检出，循环miRNA具有良好的稳定性，采用

4、常规总RNA提 取方法就可以获得满足实验要求的 miRNAs,目前的研究显示循环 miRNAs可 以作为乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌及肠癌诊断及预后分子标记物。循环 miRNA检测方法与组织内 miRNA检测方法相近。主要有：Northern Blot法、高 通量测序法、miRNA芯片和荧光实时定量PCR,目前认为qRT-PCR方法操作快 速、简便、高效，而且具有较高的敏感性和特异性，适用于初步筛选后大样本的 验证。循环月中瘤细胞（CTCs）、循环月中瘤DNA （ctDNA）和循环miRNA都属于生 物标记物，可以提供月中瘤来源的基因信息。CTCs最大的优势是DNA具有完整 性，而ctDNA是

5、降解的DNA片段。然而由于月中瘤异质性，CTCs无法在脱离 微环境后充分展示原发月中瘤的分子特征，而且其捕获依然困难重重。而 ctDNA 可以展示原发月中瘤所有的突变，而痕量即可供临床检测（1 -100 ng/mL）。miRNA 分子在不同病理生理状况下呈特征性表达，以此也可以监测病情的发展和预后。研究进展三种生物标记物的应用涉及到宫颈癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、结核病、肺 癌（非小细胞肺癌）、结直肠癌等疾病中。月中瘤来源的循环细胞，循环核酸在月中 瘤的早期诊断、病情监测和治疗效果评估及预后等过程中的重要性在很多月中瘤病 人中被证实。循环月中瘤细胞（CTC）:聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应及其

6、各种改进技术成为目前检测循环 月中瘤细胞最有效的方法，其检测循环肿瘤细胞的原理是以上皮源性月中瘤细胞的mRNA为标志物，其优点是敏感性较其他检测技术高，可重复性好，价格低廉， 患者易于接受。研究表明，很多癌症早期月中瘤细胞已经隐匿在外周血中，逆转录聚合酶链反应有很高的敏感性，可以在 5X 1055X 107的外周单核细胞中检测到 1个月中瘤细胞。研究显示，循环月中瘤细胞监测数值越高，提示疾病的预后更加不 良，如在转移性乳腺癌患者接受治疗之前，每 7.5mL外周血中循环月中瘤细胞大 于5个，就说明患者更短的无进展生存期和总生存期 1。常用的宫颈癌的月中瘤标志物主要有：鳞状上皮细胞癌抗原（squa

7、mous cell carcinoma antigen, SCC-Ag)、细胞角质素 19 片段(cytokeratin fragment 21-1, CYFRA21-1)、糖类抗原 125(carbohydrate antigen 125 CAl25)等。按病理类型：鳞状上皮细胞癌大约占宫颈癌的85%,鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)是一种糖蛋白，是宫颈鳞状细胞癌的血清月中瘤标志物，在宫颈癌中 表达显著。相关研究表明，患者接受治疗后， SCC-Ag值1.15因/L提示患者有 更高的3年生存率2。细胞角蛋白(CYFRA21-1)首先被作为肺癌月中瘤标志物，是 CK-19的一个片 段，在上皮月

8、中瘤中具有重要价值，但是在一些良性疾病中也有表达，在42%-63% 的宫颈鳞状上皮细胞癌患者血清中 CYFRA21-1升高。CYFRA21-1与宫颈鳞状上 皮细胞癌的预后因素有关，如宫旁浸润、淋巴结转移及月中瘤大小对月中瘤分期及选 择治疗方案至关重要，没有宫旁浸润是手术治疗的最佳指征，有宫旁浸润最适合放疗，对临床治疗提供了有价值的指导作用3。据报道，CK19已成为上皮细胞及上皮来源月中瘤细胞较为敏感的标志物4,CD45是正常白细胞特有的表面抗原，在富集过程中，有少量白细胞未能全部去 除，在观察中必须排除白细胞对 CTCs鉴定结果的干扰。一般在实验中将 CK19 阳性/CD45阴性的月中瘤细胞认

9、定为循环月中瘤细胞。在非小细胞肺癌患者中，当月中瘤样本难以获得时，通过抽取病人10mL血样 测定ctDNA分析表皮生长因子(EGFR)突变水平，对患者进行EGFR酪氨酸激 酶抑制剂治疗5。循环microRNA可作为宫颈癌早期检测生物标记， 通过对213 例患者和158例正常对照血清样本测序，初步筛选出具有差异表达的miRNAs,经过功能验证发现 miR-21, miR-29A, miR-25, miR-200A 和 miR-486-5P 五种 miRNA可作为宫颈癌生物标志物6。有研究表明血浆循环microRNA是用于检 测和监测肝细胞癌(肝癌)的一种新的诊断标志物，并且不受肝功能和不同病因

10、的肝脏疾病的影响，在NCBI数据库中选择在肝细胞癌组织中高表达的miRNAs ,发现高表达的miR-224在血浆中的水平与在HCC组织中的水平配对，并且血浆 中的miR-224水平与月中瘤大小呈相关性7。循环月中瘤细胞检测方法:免疫磁性分离法循环月中瘤细胞富集技术检测技术细胞计数法、核酸检测法:密度、梯度离心法膜滤过分离法，免疫细胞化学技术、流式细胞术PCR、qRT-PCR循环月中瘤DNA检测方法：定性分析：对月中瘤特异性基因改变情况检测放射免疫分析ctDNA检测 定量分析对流免疫电泳qRT-PCR II直接测序（ctDNA突变分析、拷贝数变化分析、染色体重排分析）循环microRNA检测：N

11、orthern Blot、高通量测序法、miRNA芯片和qRT-PCR参考文献.德亮.乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测及其临床应用D.苏州：苏州大学， 2010.Kawaguchi R, Furukawa N, Kobayashi H, et al. Posttreatment cut-off levels of squamous cell carcinoma antigen as a prognostic factor in patients with locally advanced cervical cancer treated with radiotherapy.J. European J

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