槟榔籽总酚的提取工艺优化和高效相色谱质谱分析论文定稿

1、 目的:优化槟榔籽中总酚的提取工艺，并利用高效液相色谱-质谱联用技术对其进行分析。摘要以提取温度、提取时间和料液比为实验因素，以总酚提取率为响应值。采用三因素五水平二次通用旋转组合设计，探讨槟榔籽中总酚的最佳提取条件。在此基础上，采用高效液相色谱-质谱联用技术对槟榔籽提取物中的主要酚类化合物进行了分析。结果表明，槟榔籽总酚的最佳提取条件为:料液比10:1(v/w)，温度72，时间121min，提取率高达16.77%。HPLC分析表明，两种主要多酚为丁香酸和表儿茶素。关键词:槟榔籽；提取；总酚:高效液相色谱-质谱前言槟榔。棕榈科植物槟榔的干燥成熟种子1。我国是槟榔的主要种植区，也有少数种植区。槟

2、榔种植是我国热带亚热带地区仅次于橡胶的第二产业2。由于槟榔抗逆性强、适应性广、管理粗放、种植成本低、经济效益好，近年来槟榔种植业发展迅速，种植面积大幅度增加。目前，槟榔产量约占中国大陆产量的99%3。2011年，全省槟榔产量达到17.47万吨，比上年增长14.9%，发展前景十分广阔。槟榔是全身之宝，是世界三大口腔爱好之一(香烟、口香糖、槟榔)。全世界大约有6亿人在吃槟榔4。在槟榔的加工过程中，槟榔籽被丢弃，但它占槟榔总体积的45%。而仅两个省，每年槟榔籽的成本就能达到上千吨，给环境清洁带来很大困难。因此，近年来，槟榔加工业诞生了一种新的回收槟榔籽废料的商业化生产模式。槟榔富含多酚和生物碱，具有

3、很高的药理活性5，6，7，8。通过研究发现槟榔籽中总酚含量较高9。以往的研究表明，槟榔中含有多种多酚类物质，如黄酮类、木质素、芪类、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸等，使其具有良好的抗氧化活性。目前，LCMS和GCMS方法可以准确地从植物提取物和生物样品中分离黄酮类和酚类的化学结构10，11，LCMS方法已经用于鉴定食品样品中的酚类化合物12，13。因此，本研究以槟榔籽为原料，采用二次通用旋转正交试验优化槟榔籽总酚的提取工艺，并采用LC-MS分析鉴定槟榔籽中两种多酚的抗氧化成分，为槟榔籽的开发利用提供理论依据和依据。1.材料和方法原材料槟榔子，2012年6月从岛上采集。样品用蒸馏水洗涤，切成小块，通风并

4、在40下干燥过夜，并通过20目筛粉碎备用。1.2.主要试剂名字纯度制造商95%无水乙醇分析纯度化学试剂厂乙酸乙酯分析纯度化学试剂厂苏打分析纯度化学试剂厂氢氧化钠分析纯度化学试剂厂酒石酸钾钠分析纯度化学试剂厂硫酸铜分析纯度化学试剂厂钨酸钠分析纯度化学试剂厂钼酸钠分析纯度国药控股化学试剂公司磷酸分析纯度化学试剂厂浓盐酸分析纯度化学试剂厂硫酸锂分析纯度国药控股化学试剂公司儿茶酸分析纯度适马股票1.3.主要仪器仪器名称模型制造商淑贤恒温水浴锅HH-S21.4金坛市医疗器械厂磨工80型徐浪机械设备厂旋转蒸发器R206B亚盛生化仪器厂紫外分光光度计722N瑞丽分析仪器公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9075

5、恒科技优先公司高效液相色谱电喷雾质谱安捷伦1100美伦公司二极管阵列检测器爸爸美伦公司液相色谱柱ZorbaxSB-C18美伦公司1.4.实验方法1.4.1.总酚的测定根据参考文献14，在1ml样品溶液中加入1ml福林酚指示剂，3min后再加入1ml。饱和碳酸钠溶液，用蒸馏水稀释至10ml。在黑暗中反应90分钟，然后在725nm处测量吸光度。以儿茶素为标准曲线(2.0-12.0g/ml；y = 0.063 x-0.0611；R2 = 0.9992)，取儿茶素mg/100g为数值，重复三次，取平均值。1.4.2样品中总酚提取率的测定总酚提取率(%)=(YV)/W100%式中:Y根据回归方程计算的总

6、酚浓度，mg/ml；v总酚提取物的恒定体积，ml；W样品重量，g。1.4.3.二次通用旋转正交组合设计实验以料液比(X1)、温度(X2)和时间(X3)为3个试验因素，以提取率(Y)为目标，采用三因素五水平二次通用旋转组合设计，共20个试验点，对槟榔中总酚的提取工艺进行优化。零液位和变化区间确定如下:料液比为10，变化区间为2；提取温度在75时为零，变化范围为10。提取时间在120分钟时为零，变化间隔为30分钟。实验结果均在DPS数据处理软件15下运行，编码因子如表1所示。表1二次通用旋转组合设计因子水平表表1二次通用旋转组合设计中的因子水平因素X1(材料-液体比)X2(温度/)X3(时间/分钟

7、)+12八十五150上层(+1)11.281138水平(0)1075120较低级别(-1)8.8六十九102-八6590改变间距(j)1.2六181.4.4.槟榔籽提取物的制备将槟榔籽洗净，40烘干，粉碎，过20-40目筛。将10g干燥粉碎的槟榔样品用70%乙醇在一定温度下以一定的料液比回流提取。然后，减压过滤，冷冻干燥提取物。然后用70%乙醇配制成5mg/ml的工作溶液，用于酚类和黄酮类物质的含量测定。将部分提取物与100ml乙酸乙酯混合，用于通过HPLC-ESI-MS分析多酚。将悬浮液收集在棕色烧瓶中，并储存在-18下用于LC-ESI-MS分析。1.4.5液相色谱-电喷雾质谱测定方法色谱条

8、件:流动相为乙腈(A)和0.5%甲酸(B)。色谱柱流速为1.0 ml /min，梯度洗脱5-25分钟为8%，0-5分钟为8-25%，进样量为20l。检测器为二极管阵列检测器，检测波长为280nm。使用标准儿茶素和丁香酸作为参照。质谱条件:ESI离子源，离子源喷雾电压5 kV，毛细管温度350，外壳气体(N2)流速35 pis，扫描范围m/z 100 800，正离子模式扫描。2.结果和分析2.1槟榔籽总酚提取工艺的优化以槟榔籽总酚提取率为指标，采用二次通用旋转组合试验设计优化提取工艺。实验结果如表2所示。测试结果均在DPS数据处理软件下运行。表2二次通用旋转组合设计试验结果表2槟榔二次通用旋转组

9、合设计试验方案及其结果普通X0X1X2X3X1X2X1X3X2X3X12X22X32Y(%)一个一个一个一个一个一个一个一个一个一个一个12.122一个一个一个-1一个-1-1一个一个一个12.67三一个一个-1一个-1一个-1一个一个一个15.28四一个一个-1-1-1-1一个一个一个一个14.11五一个-1一个一个-1-1一个一个一个一个7.05六一个-1一个-1-1一个-1一个一个一个6.48七一个-1-1一个一个-1-1一个一个一个12.35八一个-1-1-1一个一个一个一个一个一个13.07九一个-1.682000002.8280010.3710一个1.682000002.82800

10、13.2311一个0-1.682000002.828014.4112一个01.682000002.82808.8713一个00-1.682000002.82810.8514一个001.682000002.82811.4115一个00000000016.0816一个00000000016.1617一个00000000016.0018一个00000000016.2419一个00000000016.3220一个00000000015.92数据测量三次(df = 3)。根据多项式回归方程Y=b0+biXi+bijXiXj+Xii2，根据20次试验结果计算拟合回归方程的系数，根据试验结果进行方差分析(表

11、3)。可以看出模型F2 = 31.5471 F0.01 (9，10) = 4.95的拟合检验，达到非常显著的水平，建立了提取率对实验因素的回归方程为:y = 16.10719+1.46739 x 1-1.88968 x2-1.44363 x12-1.50020 x22-1.68051 x32+0.91125 x表3实验结果的方差分析表3测试结果的方差分析变异的来源平方和自由均方比率f显著水平pX129.4064一个29.406448.75280.0001X248.7673一个48.767380.85120.0001X30.1459一个0.14590.2420.6334X1230.034一个30

12、.03449.79320.0001X2232.4338一个32.433853.7720.0001X3240.699一个40.69967.47480.0078X1X26.643一个6.64311.01340.7332X1X30.0741一个0.07410.12290.8487X2X30.0231一个0.02310.03830.0001返回171.2552九19.0284F2=31.54710.0001留下6.0317100.6032错配5.9197五1.1839F1=52.85480.0001错误0.112五0.0224总数177.286919频率分析方法用于寻找最佳工艺。数学回归模型的频率分析

13、结果如表4所示。在95%置信区间内提取率大于12.95%的最佳方案为:液料比为10.06-10.84，提取温度为68.98-77.30，提取时间为114.97-125.03min。为了更接近实际工业生产，确定了最佳方案为:液料比为10: 1，提取温度为72，提取时间为121该方案的提取率为16.77%，接近优化方案的理论值16.86%。表4组合应用中各因素的频数分布表4联合应用中Xi的概率分布因素水平X1X2X3频率频率频率频率频率频率-1.68200.000五0.227300.000-1三0.1364八0.3636五0.22730九0.4091八0.3636120.5455一个八0.3636

14、一个0.0455五0.22731.68220.090900.00000.000 x0.38-0.700天语0.1670.160.14495%的置信度0.0530.707-1.0130.387-0.2820.282提取条件10.1-10.869-77115-1252.2单因素影响分析为了进一步分析料液比、时间、温度对试验结果的影响，采用降维分析法，将其他因素固定在0水平，进行单因素效应分析，得到如下单因素模型。y1 = 16.10719+1.46739 x1-1.44363 X12y2 = 16.10719-1.88968 X2-1.50020 X22Y3=16.10719 -1.68051 X

15、32根据上面的模型图，得到单因素效应曲线1。从图1可以看出，总酚的提取率随着X3因子(时间)的延长而增加。当编码值达到0.049019，即提取时间为121.4706min时，提取率最高，与现有技术最一致；而当提取时间X3的编码值大于0.049019时，总酚的提取率随着时间的延长逐渐降低，说明提取时间过长不利于提取率的提高。X1(固液比)和X2(提取温度)对提取率的影响与X3基本相同。不同的是，X1(固液比)的提取率在编码值达到0.343763时最高，即固液比10.6865，而X2(提取温度)的提取率达到-0.52629，即提取温度69.7371。图1单因素效应曲线图1单因素对提取率的影响2.3

16、双因素交易分析将建立的回归模型中的任意一个因子固定在零水平，得到另外两个因子的交互作用结果。二次回归方程的响应面及其等高线见图2-4。从图2可以看出，随着固液比和温度的增加，总酚的提取量先增加后缓慢下降。当固液比为10.60: 1，提取温度为72.03左右时，提取率达到最大值。提取率对料液比的变化比对提取温度的变化更敏感。从图3可以看出，随着固液比的增加和提取时间的延长，总酚的提取率先上升后缓慢下降。当固液比为10.60: 1，提取时间为120min左右时，提取率达到最大值。提取率对料液比的变化比对提取时间的变化更敏感。从图4中可以看出，随着提取温度的升高和提取时间的延长，总酚的提取量先快速上

17、升后缓慢下降。当提取温度为77.97，提取时间为120min左右时，提取率达到最大值；提取率对提取温度的变化比对提取时间的变化更敏感。根据以上分析，料液比是影响槟榔籽总酚提取率的主要因素，其次是提取温度，而提取时间对槟榔籽总酚提取率影响不大。图2固液比与温度的相互作用图2液固比(v/w)与温度的相互作用图3固液比与时间的相互作用图3液固比(v/w)与时间的相互作用图4温度和时间的相互作用图4温度和时间的相互作用2.4槟榔中酚类化合物的分析与鉴定HPLC中的DAD检测器用于分析每种乙醇提取物的色谱峰。为了进一步确定其结构信息，实验中选择了正离子模式扫描，用HPLC-MS分析了槟榔籽乙醇提取物中的

18、两种抗氧化成分，分析结果见图5、图6、图7和表5。电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明，槟榔籽乙醇提取物乙酸乙酯部分的主要酚类成分为表儿茶素(c 15 h14 o 6；MH+ 291.27)和丁香酸(c 9 h10 o 5；MH+ 199.17)。槟榔不同部位的酚类化合物不同，但槟榔中没有大量的丁香酸和表儿茶素。目前已有一些关于槟榔成分和药理作用的报道，如从槟榔中提取的多种鞣质，如槟榔碱A1、槟榔碱A2、槟榔碱A3、槟榔碱B1、槟榔碱B2和槟榔碱C1等。从槟榔的乙醇提取物中提取了五种酚类化合物:异鼠李素、黄姜素、洋地黄黄酮、()-4 ，5-二羟基-3 ，5 ，7-三甲氧基黄酮酮和厚壳素。但关于槟

19、榔籽中总酚类物质含量的报道很少。图5丁香酸和表儿茶素混合标准溶液的HPLC图谱图5丁香酸和儿茶素混合标准溶液的色谱图槟榔籽70%乙醇提取物中丁香酸和表儿茶素的色谱图。图6槟榔70%乙醇提取物中丁香酸和儿茶酸的色谱图图7 MS- MS谱如下:丁香酸和丁香酸异构体的质谱。儿茶素B和儿茶素异构体的质谱分析图7烟酸和烟酸异构体的质谱图。儿茶素和儿茶素异构体的质谱图两种酚类化合物的液相色谱-质谱信息。表5两种酚类化合物的LC-TOF-MS光谱信息酚类化合物分子量M-H+(质谱碎片)保留时间(分钟)一个丁香酸198199 (183,154)11.622表儿茶酸290291 (246,180,126)12.

20、673.结论(1)通过双因素交互分析发现，料液比是影响槟榔籽总酚提取率的主要因素，其次是提取温度，而提取时间对槟榔籽总酚提取率影响不大。本实验采用二次通用旋转正交组合设计优化了槟榔籽总酚的最佳提取条件:料液比10:1(v/w)，提取温度72 ,提取时间121min，提取率高达16.77%。(2)HPLC-MS分析鉴定出两种主要的多酚化合物，即表儿茶素和丁香酸。致谢我要感谢韦敏先生完成了这篇毕业论文。老师们在论文收集、实验设计、论文进度、论文写作等方面都给予了宝贵的意见和极大的帮助。当在实验中遇到任何困难时，老师总能帮助解决。老师以严谨的学风，和蔼可亲的生活态度，积极负责的学生态度，在学习生活上给予学生无微不至的关怀，让我受益匪浅。在此，我表示感谢和深深的敬意。值此毕业论文完成之际，我还要向所有关心过我、帮助过我的老师和同学们，向在我学习期间给予我支持和热情帮助的食品学院全体老师，表示诚挚的感情和良好的祝愿。参考1海中，钟海燕，金星等。槟榔提取物对小鼠的抗菌作用J.食品与机械，2007 (10): 81-832黄永华。槟榔有效化学成分的分析与测定J.食品与机械，2002 (3): 38-393省农业厅提出解决2008年槟榔产销问题的建议。4曾琦，钟海，袁烈江，等.槟榔生物碱的研究现状与展望J.食品与机械，2