免疫实验课：双向琼脂扩散试验

1、实验、双向琼脂扩散试验实验目的：了解双向琼脂扩散的原理和用途。掌握抗体效价的测定方法。观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。实验原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散， 当抗原与抗体相遇，在

2、比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。双向琼脂扩散试验一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。 免疫学及免疫学检验 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系 免疫学及免疫学检验 (1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相

3、同。(2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。A1：待检抗原；A2：标准抗原抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。 免疫学及免疫学检验材料与试剂1琼脂粉2微量加样器、打孔器、载玻片、湿盒、温箱3. 抗原 健康人血清，用生理盐水做1:5-1:40系列倍比稀释5. 抗体 羊抗人IgG抗血清操作方法1称取一定量的琼脂粉，按1.5%（10-15g/L）的

4、比例加入生理盐水，煮沸融化。2取一张洁净干燥的载玻片，置于水平台上，用吸管取充分混匀的抗体琼脂液4ml浇于载玻片上，置于室温冷却凝固。制板要求布满整张玻片，切均匀平整，厚薄一致无气泡。3根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径35mm）打成梅花形孔图。4可用注射器针头挑出孔中琼脂。孔要求打得圆而光滑，边缘不能有破裂。5在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。6吸取样品加入孔内(约10ul)，以加满为度。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。7扩散 将加样的琼脂凝胶板放在湿盒内，置于37度，24h后观察结果。若沉淀环不清晰

5、可用1%的鞣酸浸泡10min。结果判定用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。1.双扩散用于疾病诊断： 以IBD（炎性肠病）诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别加IBD标准抗原、生理盐水、待检抗原1.2.3.4。2.双扩散用于抗体检测： 以免疫鸡IBD抗体检测为例，中心孔加IBD标准抗原，周围孔分别加IBD标准阳性血清.、 IBD阴性血清、待检血清1.2.3.4。双向免疫扩散的影响因素：1抗原、抗体因素1.1抗原、抗体的水溶解性1.2抗原的决定簇数量及分子量1.3抗体的单一性1.4抗原、抗体浓度和纯度1.5 抗原、抗体的反应比例1.6抗原抗体反应的可逆性2琼脂板因素2.1琼脂的浓度、粘度2.2 pH值2.3电介质2.4孔间距离2.5琼脂板的厚度2.6其它（例：琼脂板中的不溶性杂质和矿物质等对实验的影响）3抗原抗体反应条件3.1反应温度3.2空气湿度3.3反应时间如果反应时间太短，抗原抗体扩散和反应不完