微生物学课件：实验八 革兰阳性球菌的鉴定（二）-肠球菌的鉴定

1、实验八：革兰阳性球菌的鉴定（二）肠球菌的鉴定精氨酸双水解试验【原理】1.L-精氨酸在其水解酶催化下，精氨酸被水解脱去氨基，生成瓜氨酸、NH3和无机磷酸盐。2.瓜氨酸的分解途径，在H3PO4和瓜氨酸尿素酶存在下，瓜氨酸通过磷酸化过程，产生鸟氨酸和氨基甲酰磷酸。氨基甲酰磷酸在二磷酸腺苷（ADP）和氨基甲酰激酶的催化下，产生NH3、CO2和三磷酸腺苷（ATP）,所以L-精氨酸经双水解后产生ATP，为细菌生长提供了能源，而所产生的物质使培养基偏碱pH升高，从而使指示剂酚红由等电点的黄色变成红色。 （此试验不需要加无菌液体石蜡不影响结果观察。）3.若细菌具有鸟氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶的脱羧生成腐胺和CO

2、2。肠球菌属简介（Enterococcus）一.分布：分类上属于链球菌科。广泛分布在自然界，是人类肠道和女性生殖道的正常菌群。二.分类：1.具有Lancefield群异性抗原D抗原（细胞壁产生的甘磷酸壁酸，多糖抗原的一种）。2.经由16SrRNA序列分析和核酸杂交证实肠球菌属可分为5群、21个种。3.临床标本分离的肠球菌多属于第2群，其中约占80%90%是粪肠球菌和屎肠球菌。三.致病性：1.最常见的医院感染病原菌。2.可引起肠道外及女性生殖道外无菌部位的感染：1）如尿路感染，最为常见。2）腹部和盆腔等部位的创伤和外科术后的伤口感染。3）败血症、心内膜炎、胆囊炎及脑膜炎等。四.生物学特性：1.形

3、态：G+c，直径0.62.0m，呈单个、成对或短链状排列，琼脂平板上生长的细菌呈球杆状，液体培养基呈卵圆形、链状排列。无芽胞和荚膜，个别菌种有稀疏鞭毛。2.培养特性：1）兼性厌氧。2）最适生长温度35，多数菌株在1045也能生长。3）营养要求不高，在血平板上菌落呈灰白色、不透明、圆形、表面光滑、边缘整齐、凸起、（灰色、湿润）直径0.51.0mm大小的菌落。通常为-溶血（溶血环较窄）或-溶血，但极少数粪肠球菌菌株出现-溶血。与同科的链球菌属显著区别在于肠球菌能在高盐、高碱（pH9.6）、高胆汁的培养基上与10和45条件下生长。3.生化反应：1）不含细胞色素氧化酶和触酶。2）水解40%胆汁七叶苷。

4、3）在含6.5%氯化钠肉汤生长。、4）多数菌种产吡咯烷酮芳基酰胺酶能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR）。5）粪肠球菌在含血培养基上可合成细胞色素酶和/或触酶，因此某些菌株触酶试验产生微小的气泡，表现为弱阳性。6）分解多种糖类产酸，不同的菌株可分解不同糖类藉此和其他的生化反应可以将待测菌分群和鉴定到种。4.抵抗力：1）肠球菌属对多种抗菌药物天然耐药：对氨基糖苷类、头孢菌素类、克林霉素和磺胺类天然耐药。2）近年来获得性耐药株也在不断增加：如耐高浓度氨基糖苷类、青霉素、氨苄西林和万古霉素（VRE）的肠球菌的出现。一、目的与要求1.掌握肠球菌的菌落特点及及油镜下菌体形态及染色特征。2.掌握鉴定肠球菌的生

5、化反应（定科、属、分群、定种的生化反应）及鉴定的思路。二、器材与试剂1.菌种： 某株待鉴定肠球菌。2.培养基 胆汁-七叶苷、 6.5%NaCl肉汤、甘露醇、山梨糖、精氨酸双水解、阿拉伯糖、 山梨醇、棉子糖、蔗糖等 微量生化反应管。3.试剂与其他 革兰染液、 3%过氧化氢、 生理盐水、接种环、接种针、酒精灯、载玻片等。三、操作步骤1.观察并描述BA上待测菌的菌落特征：2.经革兰染色后油镜下的形态及染色性：3.生化反应：以无菌操作做一下试验：1）触酶：2）其他生化反应：以无菌操作将待测菌接种以下培养基中：胆汁-七叶苷、 6.5%NaCl肉汤、甘露醇、山梨糖、精氨酸双水解、阿拉伯糖、山梨醇、棉子糖、

6、蔗糖，35培养1824h，4.记录结果。该细菌鉴定为：肠球菌。 四、鉴定肠球菌的思路1.定链球菌科的试验：革兰染色，阳性球菌G+c ；触酶试验，阴性 。 2.定肠球菌属的试验 :胆汁-七叶苷试验，阳性； 6.5%NaCl肉汤生长试验，阳性；吡咯烷酮芳基酰氨酶，阳性。3.分群的试验：（II群）甘露醇产酸，阳性； 山梨糖产酸，阴性；精氨酸双水解试验，阳性。4.定种的试验：山梨醇产酸，（）； 阿拉伯糖产酸，（）；棉子糖产酸，（）；蔗糖产酸：（）。五、注意事项1.粪肠球菌某些菌株触酶可以弱阳性，应视为阴性，千万不要把它当作阳性，否则鉴定时易发生方向性的错误。2.做触酶试验应挑取菌落时，应避免挑取血琼脂，因为血液成分含有过氧化氢酶，易出现假阳性.3.在进行胆汁-七叶苷和6.5%NaCl肉汤试验时，接种细菌量不可过大，否则细菌不需要耐受生长，其本身固有的酶就可以分解培养基中的底物，从而导致假阳性。 爱是恒久忍耐，又有