琼脂糖凝胶电泳技术原理和方法

1、关于琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法第一张，PPT共二十页，创作于2022年6月一 实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法检测碱裂解法提取质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果（后续实验）检测PCR法鉴定质粒的结果（后续实验）第二张，PPT共二十页，创作于2022年6月二 实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔

2、，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。第三张，PPT共二十页，创作于2022年6月琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。 表1 琼脂糖凝胶的浓度与DN

3、A分子大小的关系第四张，PPT共二十页，创作于2022年6月三 仪器、材料与试剂1.质粒样品、酶切样品和PCR样品。 2.凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。 3.琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液、Goldview、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（Marker ）等。第五张，PPT共二十页，创作于2022年6月1.凝胶电泳系统DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell 第六张

4、，PPT共二十页，创作于2022年6月2.凝胶成像分析系统第七张，PPT共二十页，创作于2022年6月3.Marker一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。第八张，PPT共二十页，创作于2022年6月4.常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操

5、作更方便。5.上样缓冲液第九张，PPT共二十页，创作于2022年6月4.常用核酸染料名称优点缺点 EB （溴化乙锭）染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。Gldview 低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。dsDNA呈现绿色荧光,而ssDNA呈红色荧光,能较好地区分dsDNA与ssDNA。 价格稍高，灵敏度 较低。背景强烈。SYBR新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。 价格昂贵。对小于50 bp染色缺失，小于100的染色效果较差。稳定性

6、差Genefinder 花青类染料,毒性很低；最大吸收峰为 470nm。具有安全、灵敏、经济的特点 重复性较差。能引起有机体突变。第十张，PPT共二十页，创作于2022年6月溴化乙锭 溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。 用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外光（302nm）。短波紫外光（254nm）观察效果较好，但对DNA的破环很大。长波紫外光（366nm）：回收。第十一张，PPT共二十页，创作于2022年6月1.制备琼脂糖凝胶（1%）2.制备凝胶板3.加样4.

7、电泳 5.染色6.结果观察 四.实验步骤第十二张，PPT共二十页，创作于2022年6月1.制备凝胶和胶板： 20ml(1TAE)+0.2g琼脂糖（ 三角瓶 ），煮胶，溶解，冷却至60(不烫手)，倒板，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。胶板设计（27人）：每11孔胶板（4人：2样品+1marker）。第十三张，PPT共二十页，创作于2022年6月5l质粒DNA+1l loading buffer 混匀；15lPCR产物+3l loading buffer，混匀；10l酶切产物+2l load- ingbuffer混匀；5l DNA Marker(每板胶一孔）2.加样第十四张，PPT共二十页，创作于2022年6月3.电泳电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向第十五张，PPT共二十页，创作于2022年6月4.观察紫外透射分析仪下观察。第十六张，PPT共二十页，创作于2022年6月六 实验结果第十七张，PPT共二十页，创作于2022年6月第十八张，PPT共二十页，创作于2022年6月 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使