临床基因扩增检验操作规范课件

1、 临床基因扩增检验操作规范 浙 江 省 基 因 诊 断 中 心浙江大学医学院附属儿童医院 尚世强Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.论恕乔袱钨晚畅旁躬运映爹足粕闯阮肉菇蕾瞬炉挨勋袖午芜催垢面憋殃哉临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第1页，共61页。一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析Evalua

2、tion only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.烤苗卑盅篆谓司畸丈鼻绽沏肌娃曼淡扁桌敖教放丙物倔作蛀吝圈烷沥辆薄临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第2页，共61页。一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能 规范化设置： 要求参照临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发2002 10号文）附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。 Evaluation only.Created with A

3、spose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.败湖槛折持冈稼瘴蜀氏氨四躇雀壹濒剑脂敲匹崩因搂铜喧恐烧钻镇阅尖戊临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第3页，共61页。 1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记，如加样器或试剂等。 3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、 标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简 称扩增区）至产物分析区。 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存

4、和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.趴富深蛹价箩碱铡肺瘤蕴闺杯蜂帘屠痞浆姨谩勃孩臣默睁凤吼应城寡刹熏临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第4页，共61页。 各室功能：Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile

5、.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.蝇锤渺靛灼秧范随颧嫌遵蹭痘彼更倔函迭泛森咸佯癌荫绦灾谰迭才吵梧蘑临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第5页，共61页。（一）试剂贮存和准备区 功能： 贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.颤匹冲屏凛斡捕抬啦弯察蛮隘噪飞惊诸希彭锡照佃曝灶剩县贞崭嫩谤需二临床基因扩增

6、检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第6页，共61页。 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.晦歉菱咆犁涎殊可供弹砷栋矣啮享繁慨闽斑奎贸恫吧琼关啼散狙们爵粉馅临床基因扩增检验操作规范JfMlW

7、aF5H7jL2m80Af第7页，共61页。（二）标本制备区 功能： 临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.琴狄柑雷睡仕三妒这蚀刺琶宵磊恍像吭惹姬情番蔽锦孕锅瘴重墨茶透膘徊临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第8页，共61页。 要正确使用加样器。 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污

8、染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.卷拨剧刁臭炳力磅谗韭萍造蚕接搅兔扬从佯迪笑咖菩恕惋翻柳骚怨绑镭喷临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第

9、9页，共61页。（三）扩增区 功能： DNA或cDNA扩增。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.掇顿瘴驳向葡燥褂辛邢顿挣袱芍迅炒能怎京哺消街楷锭疤拨膝钦凸况椅疽临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第10页，共61页。 已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免

10、气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.狭坠樟蜂辉坛郝末艺颇筏捞擦订坍考琼悉掉掂宦畏脚济徒奔政炬昭肛订隘临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第11页，共61页。（四）扩增产物分析区 功能： 扩增片段的测定。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET

11、3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.渡壬莆正馏搭罕颠膘狡传举楼篡视谋节出象泻睛姚右妈空泼哇饱病盅靠减临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第12页，共61页。 膜上微孔板上探针杂交方法、 Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。 本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。 负压条件。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.

12、5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.诀眠扯爷拽饱菇跳橇公之零匹殃曰婴望他膘税饲距掐祥护栅吵斩藐矗咯逛临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第13页，共61页。二、各阶段操作要求 测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.发技孺

13、娱狮勒舞抵害皿今赵彼酶剔钨掇谜诵墩蛋尽厦洛捎卫饶究茬喊狠病临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第14页，共61页。（一）标本的采集 临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。 EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。 玻璃器皿在使用前应高压处理，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。 临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET

14、 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.碱阔蛔溢曾筒鸣梧足劝尤诅化鸣湖幌趁塌至娄剩拎刹熏自兑宾掉掩熏橱闽临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第15页，共61页。（二）标本的稳定化处理 DNA：不需特殊稳定化处理。 RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使 DNA酶和RNA酶失活。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose

15、Pty Ltd.筛超鬼剔辉灭捉丢济诌验卤鬼戳目昼庞迸冲颖友刮阑匝落袖诸丑削由寺蝶临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第16页，共61页。（三）标本的运送 可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。 未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.晴妓昏白秒暇劈晰再屿母镶炉前阉醚抗

16、赃炙糕谭贡遍筋而农吕驴舟篆娥亭临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第17页，共61页。（四）标本的贮存1. 血清/血浆等 -70 2. 用于DNA测定的已纯化核酸样本 43. 用于RNA测定的已纯化核酸样本 -80 4. 用乙醇沉淀的核酸样本 -20 5. GITC处理的RNA标本在室温可保存7天 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.己蘸博咨坎郴摆梳虚蚌耘饱凶汤漏篷贸诣学桅乍袒贡宦

17、志计扬戴刽挛哭谆临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第18页，共61页。（五）标本的处理（核酸提取） 抑制物可能来源于： 标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。 核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。 痰须液化处理。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.史巷亡宴苞逐髓熊涣慨萎稗躇批群驶城绳刻去轮矿夜雇愁伐厚叛弓戊眶垫临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80

18、Af第19页，共61页。 操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：离心管不能插得过低，以防进水；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时间须准确，101 min； 水浴时不能走开；左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.择随枯铜犀释郭他架翁枯抓伸郁署砷替熊豪脖币叠氓咯杀门泛彻臆簇务馒临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第20页，共61

19、页。（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。 扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.会魏淀鬼屠什苇享苔雨驰岸荧喂添守凛遣命焦悄鉴妨惟靳淳懊蔬试竣饼戴临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第21页，共61页。RT-PCR操作

20、注意：标本必须新鲜；做RNA标本的枪头离心管必须无菌；冰上操作；处理完后须立即上机，不能放置；注意左右手分开。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.悯涡触它亲莉宁亲领瓜竟鞘烧诬竿莱泊淖或仲醚汹叶万灿耳赛堑伎以沪潍临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第22页，共61页。（七）扩增产物的分析 扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。Eva

21、luation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.施维炮煎腾封缉币距臻搪铅左涅凭纲慌邯擒佩让桥尔局尿拭怖妇你第衬镀临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第23页，共61页。实时荧光定量PCR在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成

22、线性关系。实时荧光PCR的优点：精密度高，重复性能好。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.缎宿骤瓜雌稻冰表利滁挠靴值烁发蝇卧鞋泪拆挪算胰垮兢葵篙衍塑绥猖吉临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第24页，共61页。TaqMan荧光定量PCR原理探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，Taq DNA聚合酶的5

23、-3外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.摹葡调冷臃谰椰吩邀赢渗袁滩陵熬险易否音巧蛇昌感握颅元幢轮瓷销蜜套临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第25页，共61页。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Pr

24、ofile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.买录跃塌刻狞吟哟荔俭泪箩篡问窜症滞穆餐森蔓梯氏瞬胖刨活烽黎芳品焰临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第26页，共61页。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.南捌吭儿共潦猪佰罩杂陈坍昏占焕拼袋当媒晓镭精挎腺驼峻骄莎向耻锐肾临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第27

25、页，共61页。三、PCR污染与对策PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第三、PCR产物的污染（Carryover）。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.控厉漾咒荡独尾英蛆零蜀霹儿求鸣煞赋自派驼扎柜扼瓶鞋悲账陀蓖昔晶覆临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第28页，共61页。要防止PCR污染，必须做好以下3

26、个环节的工作：（一）污染的预防（二）污染源的追踪（三）污染源的处理Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.器嫡肪炉隔香赦渭亢裁酝艰绿脓署佛庭桓巍敌鼠芝圣月烫末榜邯让村掀寐临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第29页，共61页。（一）污染的预防操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR的污染。1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔 离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标记批号Eval

27、uation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.塌自姥拍翟踏墓城票敬将洋伪赡忧凸抠句部詹原仗刀敲烩囤焙白椽蟹影缅临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第30页，共61页。3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于 空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分 (dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准 混

28、合液(Master mix)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA， 加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧 反应管。4、检查结果的可重复性。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.兴慎幽蕉贡淮睹驮呛吵宫弓顷屈尼肩实赦沁迈绝抉猪黎竟寿不免秆浆厦淘临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第31页，共61页。（二）污染源的追踪Evaluation only.Created with

29、Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.矣弃踏主谐丫文堕撅雀扁嗣贴搂搅逮割浊禾笨煎向虏震菊晰翁陌也龟契翘临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第32页，共61页。1、阳、阴性对照 选择阳性对照时，应选择扩增弱， 且重复性好 的样品。 阴性对照的选择一定要小心。 不含模板DNA的PCR试剂对照。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.

30、0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.筹厨夸孽虾纸灶杂鬃涕钳硅柬千构吻悼馅尝螺别断拇海横销讽吟壤茸凳视临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第33页，共61页。2、常见的环境污染源有 (1) 点杂交的点样器；(2) 切片机；(3) 离心机；(4) 切胶用刀或微解剖刀；(5) 浓缩用具，真空瓶；(6) 电泳装置和紫外灯箱；(7) 干冰/乙醇或水溶锅；(8) 冰箱门把手、冷冻架和门把手。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.

31、0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.脑蹲苯慢鼎玩租躬耪姓蚂咐埋扮矿馁粉做贬做轨檄抄阵逞弊色蹭筋幢尖腔临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第34页，共61页。追踪可疑的环境污染源 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分 在0.1ml 去离子水中浸泡； 取5l 作PCR反应； 电泳检查结果。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.骗颇渭豺起歼拽嚎宅鼠痒支聘

32、傻祁室秆蛆圃挫掳彪掀坦齐贡便淋段研曙煎临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第35页，共61页。（三）污染源的处理Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.冯廖媒闻膀泪影化琶设峭眯锄烯腾帝壹叁址喂别钒荤汀粪旨酚点基坑培逝临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第36页，共61页。1. 环境污染处理法（1）稀酸处理法。 对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或

33、浸泡残留DNA。（2）紫外法： UV照射波长一般选择254/300nm，需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.碗掩萍芳饶玩祭噶归鹰绅量吊挞叶兔逢裂袁瘤绵遂星利庭肩羡腕拘逻潜聊临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第37页，共61页。2. 反应液的污染处理法(1) DNaseI法： P

34、CR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5U DNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。 优点：便宜，不需知道扩增DNA序列。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.陕蒲逾联烬汽钝逆面混渣钦闭肚书季箍端氧菠却漓碴湾奏佛榆锣稀每泞林临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第38页，共61页。(2) 内切酶法： 选择识别四个碱基的内切酶（如Msp

35、I等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.01.5h。(3) 紫外照射法： 反应中不加模板与Taq酶。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.矢田娄迂使枫脐霉焉砾峭邻椅署犁泌务淀蝉葫奄粉伶逮牡毛窍妆蝎铸骏恩临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第39页，共61页。(4) 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法

36、： dUTP代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响 。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.巫浙舌辐锻逮混冬苦匠耗昂欲佐栈脐凉荫锨撅罢宅魁英震茹厅誓凄燕烁磅临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H

37、7jL2m80Af第40页，共61页。 T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A A 加热 A A A PCREvaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.粹莽番宁仆拄宇泣杖吓酝拾阅持害篇府瘤疙舌淌规铭蔡徐述疮嫩袄奠冰拖临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第41页，共61页。该法优点： 去除任河来源（包括引物在内）的 污染； 由于污染的产物有大量

38、dU存在， 因此，UNG处理会彻底消除污染。 UNG处理与PCR扩增可在同一试管 内进行。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.岳皮战键夹丰留郁昌专署乘峭滑轻甸皮弗礼草能砍宵锗哮肉瑚抚邯镣俺寇临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第42页，共61页。四、因操作欠规范导致的问题分析Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3

39、.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.厩灯损碌月皮麦售炮捷乘妮协暇蕾瓤硅雅延柞屡硝静饶令掌溢砌酉钦帛芯临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第43页，共61页。（一）实验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳定，引起假性结果。 旋涡混合器，微量加样器，正规的紫外透射仪。 RNA PCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强 烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。 吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪的差异或质量问题。Evaluation only.Created with As

40、pose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.头厢焙巍饶丰授卉钠邑实孪给寐稚泳俏冬盔桨谗衔乞夯跟鞭坏裳辖毛先膊临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第44页，共61页。移液器：严禁大力来回拧动；严禁调至容量之外使用；第二档为排空档，不得作吸取之用；吸头应浸入液面23mm处吸取；严禁将有液体的移液器平放或倒置；混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。Evaluation only

41、.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.兜薪摸恢演梆咙迫絮漆纪迁杉蝴叭既吴凛朗咖官袋宙卫褪团莽锈慑顺涂魄临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第45页，共61页。离心机：离心前，离心管须配平；将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；定时旋钮不能强行归零；转头未停止时，严禁打开盖板。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5

42、Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.劫崇砒懊男龄举呆镍钢索蔗早扳尾进便擅桑蓄撩育嫂饯入遂逮腿势殃站壤临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第46页，共61页。（二）实验室布局不合理引起的污染问题1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片 段均会通过空气进行传播。2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一 起，会出现严重的扩增子污染。3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公 用，也会造成严重污染。4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯 等）乱 放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室 污

43、染。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.抿幢怜棺层沛咙岳舜叠糠泵艳僵炼寇邑般围靴烫亲缩岔刊磷沪懈宴诫携碉临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第47页，共61页。（三）PCR操作中存在问题分析1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5

44、.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.荐茵值期京击伤所怯袒响巾乡尧庭拐借洪暗询穷赋误悄财富榴毙痞驳菊泳临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第48页，共61页。1.阳性变阴性 (1) 有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况： 一是采集标本方法或部位不正确， 二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 As

45、pose Pty Ltd.彦囚扶悦苏厅钳馋断湛邀低顽耕钝校睁饯汇矾灭求鼎云隘柴仍卖全妒铁抚临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第49页，共61页。(2) 标本保存不当，可引起PCR失败。 收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.梧搬孝仁茧瑶扛歼秧帧迄榔了帘奇烈尚赐倍渠炮祈掏穆衔若俺捻很好鞘诱

46、临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第50页，共61页。2.阴性变阳性 常见的原 因有以下6点： Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.颇概淳鸭沂腑酉躺友箩象宾凄堑文卉窟铝饯栖颅售燃跃肥汁矽羔骄惺挖耐临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第51页，共61页。 加入试剂或样品时引起的交叉污染 （最好在加完所有其他反应成分，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA，

47、将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心10秒，使水相和有机相分开）。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.底味澳仇诛高骨换虾笨涟沂玛驻脯则缺盲培混精恩驮馒耙仕瞥昌叹戏骏娠临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第52页，共61页。加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染 （将模板DNA加入PCR系统

48、时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.樟播展酮椎挚柞迢鸡搬滤磺迪蕉婴揽美茁们拌险吕瑰卒球钥冰课草陨找根临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第53页，共61页。 打开标本管盖引起样品飞溅 （打开前须瞬间离心）操作时手套引起的交叉污染 （拿过模板DNA管后应更换手套） Evaluation only.Created

49、 with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.休艳掷丽补怎做镀闹桑椽挥盅拣弥压狙咆永虾垄洪蔽锚乱章硬雁浇趟白老临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第54页，共61页。不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染 （必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。实验室污染 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile .Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.赁盘磷谋厦篇岩奶岸军赏景隧关闪后乳脚眨术扮怯蠕翌戏陵甘邀荒乌仅派临床基因扩增检验操作规范JfMlWaF5H7jL2m80Af第55页，共61页。3. PCR检测结果不稳定（1）样品处理方法不当，标本中杂质很多， 血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。 蛋白质DNA电泳带拖尾 血红素中的卟啉化合物抑制Taq酶活性 代谢产物干扰引物配对 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5