基因工程专题1：基因芯片和第二代测序技术简介

1、一、基因芯片gene chip技简介生物芯片biochip基因芯片gene chip, DNA chip, or DNA microarry根本概念GeneChip主要是用Northern blotting的原理，将Northern Blotting的探针固定在特定的固体基质上，而原来印记在膜上的目标RNA进行标记，然后进行的大规模的杂交。The Dimensions of a GeneChip5”5” Up to 6,500,000 features / chip1.28cm1.28cm5m5m *Millions of identical probes / feature基因芯片的制作方法

2、原位合成芯片 光蚀刻原位合成法Affymetrix、电化学原位合成法、喷墨式原位合成法点样芯片 针点式点样法、喷墨式点样法 原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA探针合成探针合成array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAAA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleo

3、tide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探针合成完成的芯片Cy3和Cy5Cy3激发波长532nmCy5激发波长635nm表达谱芯片实验流程1、别离RNA10g2、标记3、杂交 预杂交4、洗片5、扫描Affymetrix GeneChip 二、第二代测序技术简介Next-generation sequencingKey Genomics Technologies1975 - Southern DNA hybridization technique1977 - Sangers chain-termi

4、nation and Maxam、Gilberts chemical DNA sequencing methods1980 - Automated in situ oligonucleotide synthesis instrument1985 - Mulliss discovery of PCR at Cetus1992 - Affymetrix (Fodors group) first gene-chip1995 - ABIs first automated DNA sequencer2006 - 2nd generation DNA sequencer on market2007 and

5、 beyond Single molecule sequencing techniques测序技术的开展双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法)1970s 同位素标记，手工1980s 荧光标记，自动1990s 毛细管电泳合成测序法第二代测序焦磷酸测序Pyrosequencing, Roche/454合成测序Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa连接测序Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD单分子测序技术第三代测序HelicosPacific BiosciencesOxford Nanopore 14厂商RocheIllum

6、inaABI技术454Solexa GASOLiD测序仪GS20FLXTiIIIIIx123序列数目（百万）0.50.51.252810025040115320单末端测序（Single-end）读长（bp）1002004003550100253550运行时间（天）0.250.30.4335658通量（Gb）0.050.10.515251416配对末端测序（Paired-end）读长（bp）2004002352502100225235250库序列长度（kb）3.53.50.20.20.2332运行时间（天）0.30.461010121016通量（Gb）0.10.529502832Solexa和S

7、OLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。ABI SOLiD包含两张芯片，这里的数据是一张芯片的量。 表1.1 目前使用最广泛的三大第二代测序平台测序能力统计信息2021年年初数据 :/3个水稻基因组/天12个水稻基因组/天10个水稻基因组/天 1994： 3亿美元测定一个人类基因组(1:10)1984： 30亿美元测定一个人类基因组未来目标：1000/100 美元测定一个人类基因组2004：3千万美元测定一个人类基因组(1:100)2006：1百50万美元测定一个人类基因组(1:2000)2021：50万美元测定一个人类

8、基因组(1:6000)Solexa 测序技术原理介绍 1Solexa 测序技术原理介绍 2Solexa 测序技术原理介绍 3Solexa 测序技术原理介绍 4Paired End ReadsFrom Shendure et alRead 1Read 2Known DistanceJumping Library ContructionFragments熊猫基因组测序使用10 kb、5 kb、2 kb片段分别建库测序TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGGRTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNMme I site:Paired End Reads are Important!Repetitive DNAUnique DNASingle read maps to multiple positionsPaired read maps uniquelyRead 1Read 2Known DistanceShendure et al 2005Solexa测序技术的特点边合成边测序sequencing by synthesis, SBS大