细胞色素C的分离纯化课件

1、细胞色素C的分离纯化 人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5（ pHpI）时，细胞色素C呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。一.人造沸石吸附细胞色素C NH3+ NH3+Z ZNa+ p P Na COOH COOH 用25硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C交换下来。硫酸铵的主要作用是降低沸石对细胞色素C的亲和力。 NH3+Z NH3 P （NH4）2SO4 P ZNH4 COOH COOH 人造沸石在酸性条件下分解,在碱性条件下变粘,所以在中性条件下使用.二.蛋白质的盐析作用 维持蛋白质亲水胶体特性的两个重要因素是蛋白质分子

2、表面的电荷和水化膜，其中任何一个因素受到破坏，都会降低胶体的稳定性，使蛋白质分子聚集而发生沉淀。 利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。 蛋白质沉淀图 盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”（Saltingout）。这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负

3、电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中的溶解度，出现“盐溶”现象。一但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子表面的极性基团所带的电荷，减少了蛋白质分子间的相互排斥力，蛋白质分子相互碰撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。由于各种蛋白质分子所带的电荷数目不同，它们在蛋白质表面上分布情况也不一样，因此将不同蛋白

4、质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大；溶解度的温度系数变化较小，在030范围内溶解度变化不大，如25时饱和溶解度为4.1molL，即767gL，0时饱和溶解度为3.9molL，即676gL。而且硫酸铵价廉易得，分

5、段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。因此，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。 用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即称为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。 饱和硫酸铵溶液法(荷氏（Hofoneister）饱和度:其定义为在盐析溶液中所含的饱和硫酸铵体积与总体积之比。)在蛋白质溶液的总体积不大，要求达到的饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某种蛋白质成分

6、所要达到的饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：式中 V0蛋白质溶液的原始体积； C2所要达到的硫酸铵饱和度； C1原来溶液的硫酸铵饱和度； V应加入饱和硫酸铵溶液的体积。 将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋自质溶液中，即可达到盐析的目的。严格讲，混合两种不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是按相等于计算的，所以会产生误差。但实验证明所造成的误差一般小于2%，故可忽略不计。 2固体硫酸铵法(欧氏（Osborne）饱和度:定义为溶液中所含的硫酸铵重量与该溶液所能饱和溶解的硫酸铵重量之比。)所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分

7、增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某种饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： X是将lL饱和度为C1的溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。C和A为常数，数值与温度有关。现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从下表中查出。 实验中得到25%(大约饱和度40%)硫酸铵的洗脱液,然后需要加入固体硫酸铵到45%(大约饱和度67%,相对密度1.24),即每0.17g固体硫酸铵/mL洗脱液,使杂蛋白析出,过滤.实验中得到25%(大约饱和度40%)硫酸铵的洗脱液,然后需要加入固体硫酸铵到45%(大约饱和度67%,相对密度1.24,在相

8、对密度1.22容易产生热源),即每0.17g固体硫酸铵/mL洗脱液(实际上0.140.18g固体硫酸铵/mL洗脱液),使杂蛋白析出,过滤. 市售固体硫酸铵中一般残留有硫酸，所以制备的饱和硫酸铵溶液的pH常在4.55.5之间广使用之前应该用氢氧化铵调节，使其pH为7。用固体硫酸铵盐析时，蛋白质应溶解于具有一定缓冲能力的溶液中，并且在加入硫酸铵时应注意溶液pH的变化，必要时加入氢氧化铵调节pH至7。在粗制硫酸铵中还含有下些重金属离子，用量大时易使蛋白质变性，在这种情况下可加入一些EDTA等螯合剂以螯合这些金属离子。硫酸铵盐析法可使蛋白质的纯度提高约5倍，而且可以除去DNA，RNA等。但盐析后的蛋自

9、质中仍含有一些杂蛋白，所以盐析产生的产品为粗分离产品需要进一步纯化。实验中通常利用离子交换层析法纯化。在离子交换层析之前，由于盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵，将影响离子交换层析。所以，在层析之前需要“脱盐“。“脱盐”有凝胶过滤法，透析法和超虑法。 本实验经25%硫酸铵洗脱的细丙溶液加固体硫酸铵使杂蛋白沉淀出来，达到分离纯化细丙的目的。 虽然单纯盐析的方法不能达到完全分离和纯化蛋白质的目的，但由于该法操作简便，设备简单，因此仍为许多实验室采用。 三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白质迅速而完全，一般会引起变性（防止出现多聚体）。但在低温下短时间作用可使有些较稳定的蛋白质或酶保持原有的活力，如用2.5%浓

10、度TCA处理胰蛋白酶，抑肽酶或用20%浓度TCA处理细胞色素C提取液，可以除去大量杂蛋白而对酶活性没有影响。此法多用于目的物比较稳定且分离杂蛋白相对困难的场合，如分离细胞色素C工艺。三.三氯乙酸沉淀 因为细胞色素C的等电点为10.4，当加入三氯乙酸后（pHpI，细胞色素C带正电荷，可与三氯乙酸生成沉淀物。这 NH3+ NH3+OOCCl P + ClH3COOH+ P COOH COOH 种沉淀物可发生可逆变化，经离心加水又可溶解。利用这一性质，往盐析过滤液中按6% 体积滴加20% TCA，边滴边搅拌，至出现浑浊为止。加时要快，要防止局部蛋白质变性，加完后立即离心（4500r/min，约5mi

11、n）。离心后，倒去上层清液，下层沉淀可加少量蒸馏水溶解。蒸馏水的量应刚好使沉淀完全溶解，避免加水过多，使细胞色素C浓度变低（ 如 离心后，发现上清液仍带红色，可加适量三氯乙酸，再次离心分离，使细胞色素C沉淀完全）。四.透析脱盐作用 透析是一种膜分离技术，利用具有不同截留分子量的半透膜，借助膜相隔的两相不等渗溶液，使高渗溶液中的小分子穿过半透膜进入低渗溶液，生物大分子被截留，使生物大分子与无机盐等小分子分离。在透析容器下面安装一个电磁搅拌器（下图），自由扩散出来的小分子很快被分散到整个容器中，这样可以提高透析效率。实验中将盐析后的细丙用去离子水溶解（体积不超过5mL）然后放在半透膜制成的透析带中

12、，于水（先用自来水透析30min，然后改换蒸馏水透析）中透析，样品溶液中的小分子由于透析袋内的高渗透压扩散到透析带外的低渗溶液中，细丙则被截留在袋内，重复更换几次蒸馏水（用醋酸钡检查透析袋周围水的SO42- ，即透析液无白色沉淀为止），就可以将细丙中的硫酸铵除去。然后过滤透析液，量好体积供测定用。 搅拌透析示意图 搅拌式超滤器 五.细胞色素C含量测定 取5支试管，按以下步骤操作：试管编号12345标准液/mL00.50.500样品液/mL0000.50.5dH2O/mL3.02.52.52.52.5还原粉少许少许少许少许少许A520nm 注明：依样品液颜色深浅适当增减所取样品液的体积，用dH2O补足3mL，使样品管与标准管颜色相近，以减少误差。计算总含量（75g心肌） 分别取2号与3号管A的平均值和4号与5号管A的平均值，并都减去1号空白管的A值，然后按以下公式计算。 标准管A520nm值：标准含量样品管A520nm值： 标准含量样品A520nm值= 标准A520nm值 总含量 稀释倍数总体积理论上250mg/1kg猪心,实际提取200mg粗品/1kg和150mg精品/1kg,但实验中大多数在710mg粗品/75g猪心.722型分光光度计使用说明1.预热：开启电源，预热30分钟。2.设定波长：旋动波