广西柠檬疫菌褐腐病病原菌鉴定

1、广西柠檬疫菌褐腐病病原菌鉴定蒋运宁1，阳廷密1，陈传武1，李红叶2，王洪凯2，叶泉清3，国立耘4，娄兵海1，付慧敏1（1 广西特色作物研究院/广西柑橘生物学重点实验室，桂林，541004；2 浙江大学生物技术研究所，杭州，310029；3 广西师范大学生命科学学院，桂林，541004； 中国农业大学植物病理学系，北京，100193）基金项目：广西科技重大专项（桂科AA17204097-8)；桂林市科学研究与技术开发计划项目（20160223-4）；广西柑橘生物学重点实验室课题（SYS2015X001，SYS2017X002）；国家现代农业(柑橘)产业技术体系项目(CARS-27)资助。第一作者

2、：蒋运宁（1963），男，助理研究员，主要从事柑橘科研及技术推广工作，E-mail:HYPERLINK mailto:摘 要 为了解广西柠檬疫菌褐腐病的病原菌确切种类，本研究通过多次采样、病菌分离纯化、人工接种等一系列研究，确定分离到了正确的病原菌。根据病原菌的形态学特征，rDNA-ITS序列和致病性，确定引起广西柠檬疫菌褐腐病的病原菌为柑橘褐腐疫霉菌(Phytophthora citrophthora)。关键词柠檬；疫菌褐腐病；形态学鉴定；分子鉴定；柑橘褐腐疫霉菌柠檬Citrus limon (L) Burmf.属芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)枸橼(Citrus medic

3、a L)类的常绿果树。柠檬全身是宝，是一种鲜食与加工兼用型高档水果。柠檬栽培主要分布在热带和亚热带国家和地区，目前世界上有30多个国家生产柠檬（包括来檬），在世界柑橘四大类（甜橙、宽皮柑橘、柠檬、柚类）中，柠檬栽培面积居第三位，占柑橘栽培面积的11%。中国是柠檬栽培的起源地之一，有1000多年的栽培历史，我国柠檬产区主要分布在四川、云南、重庆、广东、广西、福建、浙江、台湾等地1。近年广西桂林市的部分柠檬果园46月份雨季突发落叶、落果和枯梢现象，主要危害柠檬果实和叶片，以树冠中下部、靠近地面的果实及叶片受害重，造成大量落果和落叶。受害叶片多从叶缘、叶尖或沿主脉产生水渍状病斑，似开水烫伤状，病健部

4、交界不明显。病斑近圆形或不规则形，病斑初为淡青至淡黄色，随后迅速转为浅褐色至深褐色，易误诊为急性炭疽病。阴雨潮湿时，病斑扩展极快，可占叶片面积的1/32/3，病叶主脉变黄，造成感病叶片大量脱落。果实发病时，先为圆形的淡灰色病斑，后渐变成淡褐色，水渍状软腐，病部稍凹陷，病健部分界明显，后期果实有腐烂臭味。干燥条件下果实病斑革质，微凹陷，按压稍有弹性，果实发病后容易脱落（见图1、）。由于该病发病迅猛，导致叶片及果实大量脱落，致使树势衰退，产量锐减，田间症状与疫霉菌引起的疫菌褐腐病相似。据报道，全世界为害柑橘的疫霉菌有14种，但在不同国家及地区，疫霉菌种类有所不同2。为了解广西柠檬疫菌褐腐病病原菌种

5、属分类地位，笔者于2017年4月2017年6月期间，多次到发病果园调研和采样，分离培养病原菌，再从病原菌形态学、分子生物学等方面对该病的病原菌进行了系统研究，然后利用形态学及rDNA-ITS序列分析方法进行鉴定，以期为有效防治柠檬疫菌褐腐病提供理论依据。1材料与方法1.1病原菌的分离与纯化1.1.1病原菌分离 从广西桂林市临桂区8年生柠檬植株上采集具有典型症状的病枝、病叶和病果，装入干净的塑料采集袋中，带回实验室进行分离培养。分离方法为：将采集到的样品表面洗净，用吸水纸吸干表面水分，用脱脂棉球蘸取75%的酒精将表面擦拭后，再在要取样的部位滴上少量酒精，用火机点燃，火灭后再重复一次。用灭菌的解剖

6、刀将烧过的病部表面组织（约2 mm厚）去除，然后切取组织小块（3 mm3 mm）,转移到1/5PDA平板上（含有5 mg/L氯霉素和60 mg/L的链霉素），培养3-5天，待从组织块边缘长出菌丝，转移到新的PDA平板上培养。1.1.2病原菌纯化从1.1.1的PDA平板上挑取生长旺盛的菌落边缘的小菌丝块转移到含有抗生素（5 mg/L氯霉素和60 mg/L的链霉素）的水琼脂平板上，培养两天。用灭菌的解剖刀在解剖镜下，切取含有单菌丝的小琼脂块，转移到新的PDA平板上，待菌落长满平板后保存。1.2病原孢子诱导将1.1.2获得的纯化病原菌转接在CA培养基（新鲜胡萝200 g榨汁、琼脂20 g/L）上，观

7、察其菌落形态，气生菌丝生长状况。将1.1.2获得的纯化病原菌转接在V汁培养基上培养，并用皮氏液诱导产生孢子囊，观察其形态特征。1.3致病性测定将1.2获得的病原菌接种到挂有幼果的无病盆栽柠檬植株上，分别对叶片和果实进行接种。叶片接种：从无病盆栽柠檬植株上采集叶片，用75%的酒精擦拭35次，晾干后放入垫有吸水纸的培养皿中，用游动孢子液进行接种。果实接种：用75%的酒精擦拭35次无病盆栽柠檬植株上的幼果，用针刺伤柠檬果实，再将菌丝块接种到被刺伤的柠檬果实上，然后套透明塑料袋密封保湿。同时用无菌水接种作对照。1.4病原菌形态学观察 在光学显微镜下，观察分离培养获得的病原菌的菌丝、孢子囊和孢囊梗的形态

8、、大小及色泽特征，并测量其大小。根据病原菌菌落形态、孢囊梗及孢子囊形态特征等性状进行鉴定。1.5 病原菌分子鉴定基因组DNA的提取：将供试菌株PGL接种到在9 cm的PDA平板上生长7天，用灭菌的接种针刮取菌落表面的菌丝，转移到1.5 mL的离心管中，加入700 L的CTAB提取液及少量石英砂，在DNA提取仪上破碎后，按照常规方法提取DNA，并置于-20冰箱中保存待用。DNA片段PCR扩增：采用通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)进行扩增核糖体DNA的ITS区域，采用引物Fm84 (5-TTT AAT

9、TTT TAG TGC TTT TGC-3)和Fm83(5-CTCCAA TAA AAA ATA ACCAAA AAT G-3)扩增cox1基因片段，采用Btub F1(5-GCCAAGTTCTGGGAGGTCATC-3)和Btub R1(5-CCTGGTACTGCTGGTACTCAG-3)扩增微管蛋白-tubulin基因片段。PCR反应体系：2 PCR buffer 12.5 L(包含 0.1 U Taq DNA聚合酶，500 mM dNTP mixture，20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2)，10 M ITS1和ITS4 引物各0.5 L，模板DNA

10、 1 L，补足ddH2O至25 L。PCR反应条件：94预变性3 min；94变性l min，54退火40 S, 72延伸40 S，35个循环；最后72延伸10 min。PCR扩增产物的序列测定委托上海生工生物工程有限公司进行。将所得序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLASTn比对，从GenBank数据库中下载相似的序列（见表1），通过Bioedit对三种序列分别进行裁剪后，将其并为一个序列,采用PAUP4.0b10软件的非加权简约法进行系统树的构建。通过1000次的bootstrap评估系统树分支的稳定性。表1 用于本次分析的从GeneBank中下载的基因片段种名菌株号GeneB

11、ank登录号文献ITS-tubulincoxIP arecaeCBS 305.62HQ643146DQ988241HQ708218Rahman等（2014）3P. botryosaP6945HQ643151EU079935HQ708222P. colocasiaeP6317HQ261539EU079907HQ261286P. gregataCPHST-BL 37 MG865503MH493945MH477746P. meadiiCBS 219.88HQ643268AY564077HQ708324P. pseudosyringaeP10443HQ261653EU080023HQ261400P.

12、quinineaCBS 407.48HQ643338AY564085HQ708386P. richardiae45F5 MH620154KX251924MH620078P. heveaeCBS296.29 MG865505AY564067HQ708301P. citricolaCH97TUL2AB367377AB974435AB688187P. citrophthoraSTE-U 7435JN606025JN605861JN605937Christoffel等（2014）4STE-U 7420JN606000JN605846JN605922STE-U 7444JN606018JN605870J

13、N605946STE-U 7456JN606024JN605882JN605958P0318JN606020JN605840JN605916P3078JN606036JN605842JN605918Vi-11JN605990JN605906JN6059822结果与分析2.1致病性测定结果接种试验表明，离体叶片用游动孢子液接种，幼果用菌丝块接种，7天后两者均出现症状，12天后病斑扩展至叶、果大部分，其症状特点与田间自然条件下发病的症状一致（见图1 A、B）。从接种发病的部位进行菌株的分离，均能获得与来自田间发病组织分离得到的菌株相同的病原菌。而接种无菌水的对照则不表现任何症状，也未分离出病原真菌

14、。根据柯赫氏法则,证明该病原菌为广西柠檬疫菌褐腐病的致病菌。我们将一个分离物记为PGL。2.2病原菌鉴定2.2.1病原菌的培养性状及形态特征病原菌菌株PGL在CA培养基，菌落呈棉絮状，气生菌丝较少；在PDA、MEA和燕麦培养基上，形成白色菌落，菌落呈花瓣放射状，菌丝发达，但是菌丝生长比常见的寄生疫霉的生长速度慢很多，菌落边缘不整齐（图2A）。在显微镜下，1周之内只见菌丝，菌丝粗壮，粗细均匀，无隔膜，内部油球多，未见菌丝膨大体和厚垣孢子，无产孢结构出现（图2B）。3周后出现孢子囊。孢囊梗简单合轴分枝，分枝不规则，粗2.34.7 m，平均3.4 m。孢子囊形态变异极大，有长椭圆形、卵形、近圆形、椭

15、圆形、倒梨形等，基部钝圆，大小为（21.484.3）m（17.641.2）m，平均55.7 m33.8 m，长宽比平均为1.6，孢子囊顶部凸起明显，具有浅色半球形乳突，一般1个，少数2个，高度3.47.6 m，平均5.2m，排孢孔宽度4.97.6 m，平均6.0 m，后期颜色鲜黄色，孢子囊在水中不脱落（图3）。异宗配合，配对培养未见有性器官产生。根据上述病原菌的培养性状和形态学特征，参照真菌分类相关文献5-7的描述，初步鉴定该病原菌为柑橘褐腐疫霉菌(P. citrophthora)。图1离体柠檬叶片及果实接种12天后病斑扩展至叶、果大部分(A、B）；田间果实、叶片发病症状（C、D）图2在固体培

16、养基上，菌落呈放射状，气生菌丝较少(A)；菌丝粗壮，管状，无隔膜，有油球状内含物(B)图3孢子囊梗和孢子囊形态2.2.2病原菌rDNA-ITS序列分析将本研究中测序得到的rDNAITS、cox1和-tubulin三个DNA片段和从GenBank数据库中下载的相关序列经过合并后，形成了2091个特征符的数据阵。聚类分析后得到了5个同等聚类树，图4显示了其中的1个。我们根据Christoffel等（2014）4的研究，将Phytophthora heveae作为外群，结果表明，本研究中分离到的菌株PGL与P. citrophthora聚类在一起，boostrap分析得到99%的支持。根据该病原菌的

17、形态特征，结合分子鉴定分析以及致病性测试的结果，将引起广西柠檬疫菌褐腐病病原菌鉴定为柑橘褐腐疫霉菌(P. citrophthora)。图4根据rDNAITS、cox1和-tubulin三个DNA片段序列分析得到的系统发育树3结论与讨论本研究通过对广西柠檬疫菌褐腐病的病原菌进行致病性测定、形态学特征分析以及核苷酸序列分析，明确了其病原菌为柑橘褐腐疫霉菌。柑橘疫菌褐腐病，又称为柑橘疫腐病、褐腐病等8，引起该病的病原可为多种疫霉属(Phytophthora)真菌，甜橙、宽皮柑橘、柚类及柠檬均可被疫霉菌感染。该病原菌主要为害成熟期果实和叶片，在田间和贮运期均能发生，可导致果实大量脱落。柑橘疫菌褐腐病在

18、世界各柑橘产区均有发生，我国以川、渝等西南地区发生严重9。近年报道湖南江永夏橙10、江西赣州脐橙11、广东梅州金柚12、湖北宜都温州蜜柑13、广西平乐沙田柚14，均遭受到疫霉病严重危害，给柑橘生产造成了严重的损失。本研究明确了广西柠檬疫菌褐腐病的病原及分类地位，为制定广西柠檬疫菌褐腐病的防治策略提供理论依据。参考文献1 王自然，郭 俊，等.柠檬苗期一种新病害的病原鉴定及防治药剂的室内筛选J.植物保护，2012，38（4）：166-1702 廖 芳，朱林慧，牛春敬，罗加凤，任学毅，黄国明，李关荣.柑橘属植物疫霉病菌检测与鉴定的研究进展J.植物检疫，2015，29（1）：7-113 RAHMAN MZ，UEMATSU S，COFFEY MDAVID，UZUHASHI S，SUGA H，KAGEYAMA K. Re-evaluation of Japanese Phytophthora isolates based on molecular phylogenetic analysesJ. Mycoscience, 2014, 55(4): 314-3274 CHRISTOFFEL F.J. SPIES，JULIA C. MEITZ-HOPKINS，SHAUN