分析生物学理论核酸的分子杂交、反义核酸技术和基因芯片技术

1、 分析生物学理论核酸的分子杂交、反义核酸技术和基因芯片技术5.核酸的分子杂交（southern blot/northern blot）（1）变性 即打开DNA双螺旋结构，变成单链DNA的过程。 变性的方法有：加热变性 有机溶剂变性 高浓度盐变性 碱变性等 常用方法是加热变性和碱变性。 DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称增色效应。当增色效应达到最大值的50%时温度，称熔解温度（melting temperature Tm值），Tm值表明DNA溶液中一半的DNA双链已解离为单链，也就是说，Tm值反映了DNA变性的程度和难易，Tm值越大，变性越难，反之，变性容易。 大多数DN

2、A的Tm值在8590左右。但Tm值并不是一个固定常数，常受许多因素影响。 DNA的碱基组成。A：T碱基对只有两个氢链，而G：C碱基对有3个氢键。因此Tm值主要受G：C碱基对数量多少的影响，有一个经验公式为： Tm69.3 溶液的离子强度。DNA链上的磷酸基团带负电荷，它们之间的静电具有相互排斥作用，可导致DNA双链结构的不稳定，比如：在无盐的水中，DNA在室温条件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA双链的稳定性增加，Tm值亦会升高。 pH值，pH值在59之间范围内，Tm值变化不明显，即DNA双链比较稳定，在高pH值情况下，可使碱基失去形成氢键的能力。当pH值大于

3、时，所有氢键均被破坏，DNA完全变性。这就是碱变性的原理。 变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲。通常用50的甲酰胺可以使Tm值降低30。 （2）复性 变性DNA的两条互补单链，或两条具有同源性的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火。 复性的（速度）过程要受到许多因素的影响。 DNA的浓度：DNA浓度直接影响到DNA单链间碰撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。 DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很难形成正确配对，因此复性速度较慢；但一旦复性，又难于变性。 温度：温度过高，有利于DNA变性而不

4、利于复性；而温度过低，碰撞机率减少，一旦形成局部错误配对，又不易解离，难以继续寻找正确配对，因而使复性速度降低；适宜的温度是较Tm值低1525。 离子强度：离子强度过低，不利于复性。 pH值：pH值在59范围内，不影响复性速度，过低或过高则影响。 DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。（3）杂交体系的建立要考虑以下几因素 DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越快。其方法有：加入足够的DNA；尽量减少杂交的体积，一般以每平方厘米滤膜面积加50100l杂交液为宜。 DNA探针的长度：在杂交过程中，待测DNA固定在

5、膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越慢，变性越慢。因此探针的长度不宜过长，一般以1050bp（一般探针20bp）。 离子强度：离子强度对变性影响较大。一般常用5或6SSC（1SSC为和柠檬酸钠）。 温度：温度对于杂交（复性）反应的快慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的因素。 一般认为杂交温度为：68（不含甲酰胺（作用：降低Tm值）；当含50甲酰胺时，在42进行杂交。 洗膜温度一般认为5565。 对于寡核苷酸探针的杂交温度，应根据下列公式推算：Tm=4G：C对数量2A：T对数量。而杂交温度一般比Tm值低5，即55。 Tm值的推算：与G：C对数量，离子强度，变性剂等有关。 杂交时间：经验杂

6、交时间816h，过夜。 减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭，同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。采用鲑鱼精子DNA（Salmon Sperm DNA）或小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA）封闭DNA非特异位点；采用脱脂奶粉封闭DNA非特异位点外，更主要封闭膜上非特异吸附位点。 促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促进DNA链间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子，从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应，促进杂交反应速度。如10硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提高10100倍。 预杂交；将膜放在预杂

7、液中，即不放探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂交位点。预杂交的温度和时间一般与杂交的温度和时间是一样的。 预杂交液：5SSC； 5 Denhardt；50mmol/L PBS； 0.2%SDS；500ug变性鲑鱼精DNA；50%甲酰胺 杂交：杂交液中除含封闭物质外，还含有10硫酸葡聚糖和探针。探针如果是双链DNA，则需要进行变性处理：沸水中加热5min，然后迅速置冰浴中（防止蛋白酶作用）；也可用碱变性处理。探针是寡核苷酸片段、单链DNA或RNA，则不需要进行变性处理。 （4）杂交操作步骤 将探针加到杂交液中，然后与膜上的待测核酸进行杂交反应。温度6

8、8（不含甲酰胺），42（含50甲酰胺），杂交时间：816h过夜。 洗液：洗膜过程是将膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定的温度下，非特异杂交体容易解链而被洗掉，而特异性杂交体由于稳定而保留在滤膜上。 注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温3765）。即逐渐增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为下一步反应（检测）做好准备。 （5）杂交信号的检测 放射自显影：探针标记了放射性核素，如32P、35S、125I或131I。其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上，

9、盖上暗盒，置70曝光一定时间。放射线可使X光片曝光，经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与探针相应序列及大小。显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在的情况下，可发生显色反应。一般情况下，大都是通过间接法结合酶。即探针标记了半抗原，如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋白的配体（avidin）结合酶，酶在有底物存在的情况下再发生显色反应。即: A B C 酶+底物 显色探针标记物(地高辛)抗体 根据显色反应斑点大小判断结果。 常用的酶碱性磷酸酶：作用底物有：BCIP（5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸） NBT(硝基蓝四氮唑)。显色过

10、程：碱性磷酸酶 BCIP 脱磷，产生H+ NBT还原 紫色化合物。辣根过氧化物酶（HRP）：常用的底物：DAB（二氨基联苯胺） TMB（四甲基联苯胺） DAB经HRP消化产生红棕色，有致癌性。TMB 经HRP消化产生蓝色，无致癌性。常用后者。化学发光反应 与显色反应基本一致，只是酶（HRP碱性磷酸酶）催化一种特殊底物如luminol、CSPD等，产生发光，而不显色。该化学光可使X光片曝光，经显影、定影后，可获得杂交斑点。化学发光是一种有发展前途的检测方法。如需准确定性和定量，可用数字成像系统进行检测。 SDS浓缩胶（5% Acrylamide）配方表 SDS分离胶（10% Acrylamide

11、）配方表三种印记技术的比较6.反义核酸技术 6.1 RNAi实验基本概念 6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计 6.3 siRNA转染过程相关问题及解答 6.1 RNAi实验基本概念6.1.1 RNAi的概念:RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。的启动途径:(1) dsRNA途径(2) siRNA途径(3) shRNA表达载体途径(2) siRNA途径:小干扰RNA，长21-23bp，双链。作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，si

12、RNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。的效应表现: RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。 6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计6.2.1 采用siRNA进行实验的途径：(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便(2) 体外转录(3) Dicer/RNase酶解这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率6.2.2 siRNA设计需要注意的问题：(1) siRNA序列设计(2) 阴性对照的作用(3) 阳性对照的重要性(4) siRNA荧光标记的问题(1) siRNA

13、的设计：理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。(2) 阴性对照siRNA的作用：阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。(3) 阳性对照siRNA的重要性：阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因；用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可

14、行等；阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。(4) siRNA荧光标记的问题：采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。6.2.3 RNAi Off-target(脱靶效应)：(1) 什么是RNAi Off-target(脱靶效应

15、)?(2) 脱靶效应如何检测？(3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？(4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？(5) 如何避免脱靶效应？(1)什么是RNAi Off-target(脱靶效应)?简单地说，就是siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目前已广泛引起研究者重视。(2) 脱靶效应如何检测？多种方法可以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片的方法。(3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会产生脱靶效应。(4)

16、 转染试剂是否也会造成脱靶效应？有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调，则会出现假阳性现象。(5) 如何避免脱靶效应？脱靶效应并不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应的发生，如针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70以上的不同siRNA序列，分别进行实验，可避免siRNA造成的脱靶效应；采用不同转染试剂进行实验可避免转染试剂造成的脱靶效应

17、等。 6.2.4 转染是RNAi实验的瓶颈： 转染质量的好坏直接关系RNAi实验的成败。(1) 选择转染方法的原则(2) siRNA转染的方法(3) siRNA转染试剂的主要种类(4) 脂质体(5) 非脂质体聚合物类(1) 选择转染方法的原则高转染效率：较高的转染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于实验结果的观察；低细胞毒性：因为RNAi是抑制性实验，转染试剂的毒性多导致细胞凋亡等结果，这种结果是对细胞正常生理功能严重干扰（主要表现为抑制），细胞无法进行正常转录表达而出现凋亡。转染试剂的毒性不仅干扰细胞正常的生理状态，甚至还可能影响实验结果；方法简单、操作简单：越简单，操作越少的实验过程，自然

18、出错的机会就少，重复性就好，工作量也少；成本较低：由于siRNA转染需要筛选有效的siRNA，有效siRNA后续大量研究还需要不断进行siRNA转染，siRNA转染的成本尤其是转染试剂的成本在实验开始之初就需要充分考虑。(2) siRNA转染的方法到目前为止，转染的方法主要采用化学方法，化学方法不能转染的采用电转化等物理方法。(3) siRNA转染试剂的主要种类脂质体类非脂质体聚合物类(4) 脂质体开发较早，主要针对转染质粒DNA等大分子开发，现在也被改良用于siRNA的转染；适合siRNA与质粒的共转以及一些对毒性要求不高的siRNA转染；代表产品有invitrogen公司的lipofect

19、amineTM 2000和RNAiMAX。(5) 非脂质体聚合物类：为克服脂质体转染试剂的毒性，并提高转染效率而开发，现在已从高分子聚合物类发展到纳米聚合物，这两年默克（Merck）、Qiagen和Clontech均相继推出了纳米聚合物类的转染试剂。英格恩生物(Engreen Biosystem)也推出了纳米聚合物转染试剂EntransterTM系列，其中EntransterTM-R专用于siRNA转染。 6.3 siRNA转染过程相关问题及解答6.3.1 siRNA转染过程相关问题：(1) 转染细胞数量的问题(2) 转染时siRNA工作浓度(3) 转染时血清的问题(4) 转染时抗生素的问题(

20、5) 转染过程(6) 转染后换液的问题(7) 转染条件优化的问题(8) RNAi效应检测方法(1) 转染细胞数量的问题：细胞数量：以转染时，细胞的汇合度在20-40为宜，这个汇合度比通常DNA转染的汇合度要小，这是因为转染后需要培养的时间通常比DNA转染的时间要长，同时较低的细胞数量也有利于提高抑制效率。需要注意的是：转染时细胞的汇合度（细胞数量）会对RNAi结果产生一定的影响。一些转染试剂，如脂质体，需要的汇合度会高一些，这是为了减轻转染试剂的毒性，一般来说，细胞数量较少更能提高抑制效率。(2) 转染时siRNA工作浓度：siRNA浓度：需要根据具体的实验进行相关的优化。过低的siRNA浓度

21、达不到相应的抑制效果，过高的siRNA浓度可能会引起一些非特异的改变。需要注意的是这里siRNA浓度指siRNA在反应时的终浓度，也就是以转染时细胞的总体积来计算的。一般siRNA的有效反应浓度在10nM-200nM。需要注意的是：siRNA的分子量，对21nt双链siRNA oligo来说，平均分子量约为13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol换算关系由于OD值受产物中其他成分影响，如荧光标记、纯度等，具体请询问合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。 (3) 转染时血清的问题：一些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h再更换成有血

22、清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R采用有血清转染，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，甚至还有助于提高转染效率。(4) 转染时抗生素的问题：一些转染试剂，如脂质体，需要在转染时采用无抗生素培养基，这是由于脂质体转染会同时将培养基的一些成份包括抗生素也带进细胞，造成细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，由于不会将抗生素带进细胞，所以可以采用有抗生素转染，避免细胞污染。(5) 转染过程：转染过程：转染的过程其实很简单。一般是分别稀释转染试剂和siRNA，然后二者混合，滴加到细胞表面，然后细胞继续培养。这点根据不同转染试剂的Protocol操作即可。(6) 转染后换液的问题：一些转染试剂要求在转染后4-6h换液，其目的就是去除在培养基中的游离转染试剂，减轻细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，大多数情况下无需转染后4-6h换