分子克隆教学课件

1、分子克隆第1页，共39页。（一）基本概念: 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。第2页，共39页。载体DNA（vector）目的DNA（target fragment）重组DNA（recombinant DNA ）宿主（host）筛选、扩增克隆（clone）分子克隆的路线DNA 重组转化第3页，共39页。分子克隆的基本过程分获取目的基因

2、和载体接目的基因与载体的连接筛重组DNA的筛选与鉴定转重组DNA导入宿主细胞第4页，共39页。目的基因的获取-PCR技术: 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。第5页，共39页。Heat-stable polymerase is vital to the ease of the processthermus aquaticusTaq DNA多聚酶的发现1988年Saiki 等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus a

3、quaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。第6页，共39页。 此酶具有以下特点： 耐高温， 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在1989年，Science将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear) 第7页，共39页。94变性 50-65退火72延伸2.PCR反应过程：20-40个PCR循环1个PCR循环第8页，共39页。PCR扩增原理引物延伸延伸55

4、33变性、退火变性、退火第9页，共39页。 模板：单链或双链DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 3.PCR基本要素第10页，共39页。4.PCR反应程序9496 30-3 预变性（使模板DNA充分变性）94 30 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）4-10 保存 25-35个循环第11页，共39页。 3.与反转录相关的PCR扩增 RT-PCR

5、（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。第12页，共39页。聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶反转录 T T TnTcDNA第一链mRNA第13页，共39页。第14页，共39页。第15页，共39页。PCR结果图第16页，共39页。 重组DNA导入宿主细胞的类型转化：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程转染：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程转导：以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程类型第17页，共39页。重组DNA的筛选与鉴定P

6、CR筛选重组体原位杂交技术4123重组DNA的筛选与鉴定方法平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 第18页，共39页。第19页，共39页。2.分子克隆中常用工具酶：（1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。 （2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。 第20页，共39页。 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。.限制性核酸内切酶(restriction endonuclea

7、se，RE)的定义第21页，共39页。限制性内切酶(Restriction Endonuclease)第22页，共39页。TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中，能以DNA为模板，从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5-3方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在7075时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3-5外切酶活性，因而无校正功能。 第23页，共39页。催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNA ligase)。DNA连接

8、酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶 .DNA连接酶：第24页，共39页。 3.基因克隆常用载体目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等 （二）分子克隆的基本过程第25页，共39页。.质粒载体：质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。 第26页，共39页。氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因： 此基因编码内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉

9、素内酰胺环，使之失效而使细菌产生耐药。 遗传选择标记： 第27页，共39页。DNA限制性内切酶DNA连接酶 100l第28页，共39页。4.目的基因的分离与制备、人工合成基因、应用聚合酶链反应获取目的基因（二）分子克隆的基本过程第29页，共39页。5.目的基因的体外重组 DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应 。（二）分子克隆的基本过程第30页，共39页。6.重组子导入宿主细胞 体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。 （二）分子克隆的基本过程第31页，共39页。感受态细胞(

10、competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，这时的细胞就称为感受态细胞。 第32页，共39页。转化过程：.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即用低渗CaCl2溶液在0时处理快速生长的细胞，从而获得感受态细胞。.此时细胞膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。第33页，共39页。（二）DNA进入细胞：.通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。.然后将细胞接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。. 挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。 第34页，共39页。7.阳性重组子的筛选和鉴定 （二）分子克隆的基本过程第35页，共39页。 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失