启动子克隆及活性分析

1、第6章CpLTP3、CpLTPI.4基因启动子克隆及瞬时表达分析为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTPl、CpLTP2、CpLTP3、 CpLTP4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以 便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了 CpLTP3、CpLTP4 基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启 动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。6.1实验材料植物材料供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内，常规管理。蜡梅 小苗通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度

2、85%，16h 光照（2000Lx），温度 25C，8h 黑暗，温度 20C。烟草 W38 （Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本实验室保存扩繁。菌种和载体大肠杆菌（Esherichia coli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus） LBA4404，用于农杆菌介导的烟草 遗传转化，由本实验室保存。克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完 整的GUS基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。主要试剂Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mg

3、cl2 dNTP、T4 DNA连接酶等购自 TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司； PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素（Ampicillin,Amp） 和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均购自上海生物工程有限公司。主要设备紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI），台式冷冻离心机 （Eppendoff），TGL-16B 型台式离心机（上海安亭），Eppendorf PCR 仪，IKA 型 涡旋器（德国产），高压灭菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳 仪（北京六一厂

4、），超净工作台（苏州净化设备厂），FR-1型凝胶成像系统（上海 复日），722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，水浴锅。常用溶液配方氨苄青霉素(Amp)：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL,-20C避光保存。 卡那霉素(Km)：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL,- 20C避光保存。TE (pH8.0)： 10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。50XTAE(电泳缓冲液),1L： Tris 242g/L,冰醋酸 57.1ml, EDTA(0.5mol/L pH 8.0)100ml/L。6x琼脂糖凝胶上样缓冲液：漠酚蓝0.

5、25% (W/V)，蔗糖40% (W/V)。基本培养基配方LB培养基(培养大肠杆菌用)参照YEB培养基(培养农杆菌用)Trptone1% (W/V)Yeast extract0.1%(W/V)MgSO47H2O0.5g/L蔗糖0.5%(W/V)pH7.0(固体培养基加1.5%的琼脂)烟草转化基本培养基MS0： MS基本成分+蔗糖30g/L，pH5.8MS1(高盐胁迫培养基)：MS0+1mol - L-1 NaCl； pH5.8MS2(干旱胁迫培养基)：MS0+25%的PEG6000, pH5.8MS3(脱落酸胁迫培养基)：MS0+100mMABA, pH5.8MS4(赤霉素胁迫培养基)：MS0

6、+100mMGA3每种处理3瓶，重复3次(5) GUS染液0.5M MES (pH5.6)9.76g MES(吗啡啉乙磺酸钠)溶解于100ml MQ-water中，调pH5.6固定液(0.3%甲醛，10mM MES pH5.6,0.3M 甘露醇)750ul 甲醛，2ul 0.5MMES,5.46g甘露醇，加水至100ml50mM NaPO4 Buffer(pH7.0)57.7ml 1M Na2HPO4,42.3ml 1M NaH2PO4,加水稀释至 2000ml组织化学染色试剂X-Gluc将10g X-Gluc溶解于100ul的二甲基甲酰胺中，加50mM NaP04(pH7.0)至 10ml7

7、0%的乙醇。6.2实验方法及操作过程蜡梅基因组DNA的提取、纯化蜡梅DNA的提取、纯化见6.2.2 hiTAIL-PCR法扩增启动子序列引物设计用Liu等人改良的TAIL-PCR: hiTAIL-PCR法扩增蜡梅非特异性脂转移蛋白基 因的启动子280。以已克隆到的腊梅CPLTP3和CPLTP4基因5端序列为基础，分别 设计3条特异的巢式引物RB0,RB1,RB2，结合简并引物LAD、及AC0/AC1，分别进 行三轮扩增。LAD1: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3LAD2: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3

8、LAD3: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAC-3LAD4: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCCAA-3LAD5: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3AC0: 5 -GGACGATGGACTCCAG-3AC1: 5 -ACGATGGACTCCAGAG-3 CPLTP3RB0: 5 - GACGCTACCTGCCCACACGTGATTG -3 CPLTP3RB1:5 -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCACGTGAGGAGAGGCCAACAGCAA -3CPLTP3

9、RB2:5 -CAGCATCAGGCACACAACAACTCCG -3CPLTP4RB0: 5 - CCGGTTCTACTTGTTGAATGGGTGG -3 CPLTP4RB1:5 -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACATGCTGCACCGGCACAGGCGC -3CPLTP4RB2: 5 -CAGAGTGTTGCGTCGGTGCCATTGC-3hiTAIL-PCR 过程以50ng的蜡梅基因组DNA为模板，用3个特异性的巢式引物和简并引物 LAD1-5,AC0，AC1为引物对，进行TAIL-PCR扩增。将预扩增的PCR产物稀释50被 作为第一轮PCR扩增的模板，第一轮PCR。各

10、轮PCR反应体系及反应条件见表6-1。表6-1 TAIL-PCR的扩增体系、反应条件Table 6-1 Amplif ication condition for TAIL -PCR反应Reaction循环体系Cycling system /gL温度条件(时间)Temperature condition ( Time)循环数Cycle No.10 x Ex-Taq Buffer293 C (2min) , 95 C(1min)125mM MgCl21.694 C (30s) , 60 C (1 min) 72C(1min)10预扩增2.5 mM dNTP1.694 C (30s) , 25 C

11、(2min) , 72C(3min)1Pre-amplification20pMLAD194 C (20s) , 48 C (1min) , 72C(3min)256pMAC0172C (5min)16pMRB01genomic DNA1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.1ddH2Oup to20第一轮扩增10 x Ex-Taq Buffer2.5Primary reaction25mM MgCl2294 C (20s) , 65 C (1min) , 72C(2min)12.5 mM dNTP294 C (20s) , 68 C (1min) , 72C(3min)6pM AC11

12、94 C (20s) , 68 C (1min) , 72C(3min)6pM RB1194 C (20s) , 50 C (1min) , 72C(3min)1350 x1st PCR product172C(5min)1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.2ddH2Oup to25第二轮扩增10 x Ex-Taq Buffer2.5Secondary reaction25mM MgCl2294 C (20s) , 68 C (1min) , 72C(3min)2.5 mM dNTP294 C (20s) , 68 C (1 min) , 72C(3min)6pM AC1194 C

13、(20 s) , 50 C (1 min) , 72C(3min)76pM RB1172C(5min)110 x2st PCR product1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.2ddH2Oup to25用1%琼脂糖胶电泳。预扩增产物通常为涂抹状，在检查少数样品后，不必对所有预扩增产物电泳检测。同一样品的第一轮和第二轮产物在相邻的泳道电泳， 特异产物产生相应的大小差异。将获得的PCR产物连接转化后送上海生工测序。CpLTP3pro, CpLTP4pro启动子片段的获得根据CpLTP3pro , CpLTP4pro启动子序列，设计含有HindiII和BamHI酶切位点 的扩增引物：FC

14、pLTP3pro: 5 - AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3RCpLTP3pro: 5 -GGATCCCTCCGCTTACTTACTCAGTCACACT-3 FCpLTP4pro： 5 - AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3 RCpLTP4pro： 5 -GGATCCTTGATGGATTTCACAGAGAATTG-3以蜡梅基因组DNA为模板进行PCR扩增，25 m l体系：10 xExTaq Buffer2.5 LMgCl21.5 rL TOC o 1-5 h z dNTP1.0rLDNA1.0rLFCpLTPpr o引物1.0 r

15、L HYPERLINK l bookmark91 o Current Document RCpLTPpr o引物1.0rLEx Taq DNA 聚合酶0.5rL (1U)ddH2O16.5pLTotal25.0LPCR扩增条件为：95C预变性5min； 95C变性45s，60C退火45s, 72C延伸 1min，30个循环；72C延伸10min。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。克隆载体 pMD- CpLTP3pro 和 pMD- CpLTP4pro 的构建对PCR产物进行回收，然后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Top10。 经挑菌摇菌后，使用通用引物进行PCR检测。提取质粒，并

16、根据以前所加的酶切 位点进行双酶切验证，最终获得阳性克隆质粒，分别命名为pMD- CpLTP3pro和 pMD- CpLTP4pro。HindiII和BamHI限制性内切酶双酶切体系(10pL)分别如下： TOC o 1-5 h z Buffer BamHI1.0pLHindlll0.2pLpMD- CpLTP3pro/pMD- CpLTP4pro 5.0pLddH2O3.4pLTotal10.0pL37 C酶切6个小时。6.2.5 植物表达载体 pBI121- CpLTP3pro 和 pBI121- CpLTP4pro 的构建酶切质粒DNA用HindiII和BamHI限制性内切酶分别双酶切克

17、隆质粒pMD- CpLTP3pro,pMD- CpLTP4pro和pBI121 载体。25pL反应体系如下： TOC o 1-5 h z Buffer BamHI2.5pLBamHI0.4pLHindIII0.2pLpMD- CpLTP3pro/pMD- CpLTP4pro/PBI12115pLddH2O6.9pLTotal25.0pL37 C酶切8个小时后进行凝胶电泳，分别用试剂盒回收PBI121载体酶切后大片 段和CpLTP3pro、CpLTP4pro启动子片段。连接将回收得到的pBI121载体和CpLTP3pro、%LTP4pro启动子片段，以1： 3左右 的比例，在T4DNA连接酶作用

18、下进行连接。连接反应体系10pL如下： TOC o 1-5 h z 10XT4DNA 连接酶 Buffer1.0pLT4DNA 连接酶0.5pLPBI121载体回收片段1.5pLCpLTP3pro/CpLTP4pro 启动子回收片段 4.0pLddH2O2.5pLTotal10.0pL16C连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态（3）重组子鉴定1）PCR 检测（同 ）2）双酶切验证10pL酶切反应体系如下:Buffer BamHI1.0pLBamHI0.4pLHindIII0.2pLPBI121- CpLTP3pro/PBI121- CpLTP4pro5.0pLddH2O3.4pLTotal1

19、0.0pL37C酶切6个小时后，进行凝胶电泳观察酶切情况。获得瞬时表达载体质粒， 命名为 pBI121- CpLTP3pro 和 pBI121- CpLTP4pro。农杆菌感受态制备、转化及转化子的选择鉴定（1）农杆菌感受态细胞的制备1）挑取LBA4404单菌落于5mlYEB液体培养基中，28 oC, 180rpm,培养过夜。2）取所摇菌液 2ml 加入 50mlYEB 中，28C 180rpm 至 OD600=0.5。3）冰浴 30min。4）4 oC, 5000rpm 离心 5min,弃上清，10ml 0.15mol/L NaCl 悬浮。5）4 oC，5000rpm 离心 5min,弃上清

20、，2ml 20mmol/L CaCl2 悬浮。6）加入15%甘油，每管100皿分装，液氮速冻，-70C保存。（2）农杆菌感受态细胞的转化1）加入1-2pg质粒，冰浴30min，液氮速冻5min，37C温育5min，冰浴2min。2）加入 1ml 液体 YEB，28C3-5h。3）重悬菌液，涂布于含相应抗生素的YEB固体培养基上。4）28 C倒置培养2-3d。（3）农杆菌质粒DNA的提取1）菌体收集同碱裂解法。2）将菌体悬浮于400皿STE溶液中，重旋、再离心、去掉STE溶液。3）再将菌体悬浮于250rL P1，涡旋混匀，加入溶菌酶50rL，37C, 3h。4）其余步骤同Watson小量质粒抽提

21、纯化试剂盒。（4）转化子的选择鉴定1）挑取单菌落，接种于3mlYEB+Km的10ml试管中，28C振荡培养2d,取菌 液为模板分别参照宫R初。和乙尸尸劫刀基因的扩增条件，做PCR检测；2）将阳性菌落放大培养，提取质粒，用BamHI/HindIII对表达载体pBI121- CpLTP3pro和PBI121- CpLTP4pro做双酶切检测是否含目的基因。农杆菌介导的瞬时表达技术检测启动子活性重组载体转入农杆菌后，以LBA4404空菌株为阴性对照，以含pBI121载体的 菌株为阳性对照，采用农杆菌介导的叶盘侵染法检测已构建的含蜡梅脂转移蛋白 基因启动子pBI121- CpLTP3pro. pBI1

22、21- CpLTP4pro的重组载体在不同胁迫环境下 的瞬时表达活性。（1）农杆菌的培养与活化将-80下保存的农杆菌菌种LBA4404（含表达载体质粒PBI121-CpLTP4pro），接 种到YEB+Km 50mg/L培养基平板上，27-280到置培养2-3d。菌落长出后，挑取 单菌落接种于含Km 50mg/L的液体YEB培养基中，27-28C180rpm振荡培养全 OD600为。将OD600为的菌液于室温6000rpm离心8min，收集菌体。 用MS液体培养基重悬至OD600备用（2）培养条件所有组织培养过程若非特别说明，都是在24-26C，16h光照/8h黑暗光周期， 1500-2000

23、Lx光强度的培养室中进行。农杆菌在28C，180rpm的恒温摇床上培养。（3）农杆菌介导的叶盘侵染1）选取生长旺盛的烟草无菌苗（转接后10-15天）叶片，用锋利手术刀片切成 1cm2小片，弃去中脉，在MS0培养基上进行预培养。2）将切好的烟草叶片浸泡于备好的农杆菌菌液中，确保叶片切伤边缘完全与菌 液接触，浸泡5min。3）倾去菌液，将感染叶片转移到灭菌吸水纸上吸去多余菌液。4）将叶片转移到MS0培养基中，叶片背面朝上黑暗中共培养两天。5）将共培养两天后的叶片分别转入4种胁迫培养基MS1,MS2,MS3,MS4中，在 28C下暗培养，处理0.5h后进行GUS染色检测活性；同时将部分在MS1中共培

24、 养后的叶片分别转移到4C和37C下进行冷胁迫和热胁迫处理。处理0.5h后分别 进行GUS染色检测活性；每种处理3瓶，每瓶4个重复。转基因烟草的GUS活性组织化学染色检测1）取出经农杆菌侵染过的烟草叶片，切成小片，放入固定液中，37C保温1h 全过夜。2）弃固定液，用50mM NaPO4 Buffer（pH7.0）洗涤材料3次。3）加组织化学染色试剂X-Gluc使之淹没材料，置于37C过夜染色。4）用70%乙醇脱色5min或更长时间排除颜色干扰，然后在显微镜下观察并照 相。6.3结果与分析蜡梅基因组DNA的提取用CTAB法提取的蜡梅基因组DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测证明DNA提取 成功（图

25、6-1 ）。图6-1蜡梅基因组DNAFig.6-1 purified DNA of the genome DNA6.3.2 3轮TAIL-PCR产物电泳结果用1%琼脂糖胶电泳检测预扩增产物，不同引物对组合所得到的产物在大小和 丰度方面存在差异，图6-2表明乙尸尸3尹0和CpLTP4pro预扩增PCR产物中 LAD1-LAD5与人。0只80组成的引物对均检测到有大小不同的扩增产物，并伴有拖 带情况出现。图6-3CpLTP3pro和 CpLTP4pro第一轮和第二轮产物同时电泳结果， 可以看出第一轮和第二轮产物在特异性上有所差异，CpLTP3pro有1条1200bp左右 的条带较特异，CpLTP4

26、pro有1条800bp左右的条带较为特异。M12345 M 12 冥 45WQbplOOObp 750bp： 。典商 Wbp .WObp图6-2 CpLTP3pro和CpLTP4pro的预扩增A: CpLTP3pro预扩增B： CpLTP4pro预扩增M: DNA Marker (D2000)； 1, 2, 3, 4, 5分别代表特异引物和兼并随机引物LAD1-5组合的预扩增PCR产物Fig.6-2 Pre-amplification of CpLTP3pro and CpLTP4proA: Pre-amplification of CpLTP3pro B: Pre-amplification

27、 of CpLTP4proM: DNA Marker (D2000)； Each set of 5 lines contains products of LAD1-5and special primer pairs, respectively.AB图6-3 CpLTP3pro和 CpLTP4pro第一轮及第二轮扩增A: CpLTP3pro一轮及第二轮产物B: CpLTP4pro第一轮及第二轮扩增M: DNA Marker (D2000) ； 1-1、1-2分别代表特异引物和兼并随机引物LAD1组合的第一轮和第二轮扩增PCR产物，同理如2-1,2-2； 3-1，3-2； 4-1，4-2； 5-1

28、，5-2.Fig.6-3 Primary and secondary amplification of CpLTP3pro and CpLTP4proA: Primary and secondary amplification of CpLTP3pro B: Primary and secondaryamplification of CpLTP4proM: DNA Marker (D2000) ； 1-1,1-2 contains products the primary and secondary amplification of LAD1-5 andspecial primer pairs

29、,respectively.2-1， 2-1， 2-2； 3-1， 3-2； 4-1， 4-2； 5-1， 5-2 are as same means as 1-1,1-2目的片段回收及测序切胶回收图6-3A泳道2-2中1200bp左右的片段和图6-3B中泳道1-2,800bp左右 的片段，连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌top10进行克隆，然后对菌液PCR 检测正确后送上海生工测序，对测序产物分别与蜡梅CpLTP3和LTP4进行同源性 比对，确认分别为CpLTP3和CpLTP4基因5侧翼序列后，设计合成特异引物，以蜡 梅基因组DNA为模板，PCR克隆更大长度的启动子序列，如图6-4所

30、示。图6-4 蜡梅CpLTP3pro和CpLTP4pro启动子的PCR扩增M: DNA Marker (D2000); 1: CpLTP3pro； 2 :CpLTP4pro； 3:阴性对照；Fig.6-4 Amplification of CpLTP3pro andCpLTP4pro promoterM: DNA Marker (D2000); 1: CpLTP3pro ； 2 :CpLTP4pro； 3: Blank经PCR扩增、胶回收、连接、转化、挑摇菌、重组子鉴定、序列测定等操作，最终获得CpLTP3和CpLTP4启动子分别为1298bp， 838bp，并分别命名为 CpLTP3pro和

31、CpLTP4pro。二者的序列差异较大，identity值为27.75%。其单链序 列分别如下：CpLTP3pro:ATTACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCTTTTTACCGGTCGTACATACCGAATATCGGCCACAATATCGGCCGATATTCAAAATATCGJTATTTAATTATTATTTTCAAAAACATCGATACGGTTTTTCACGATTTTTACACGTTTTTCACGATTTTTGACGGTTTTTCJTGGTTTTTCACGGTTTTCAACGGTTCAGGGTTTACGGGTTTCACGGGTTCTCACGGTTTTTTTGCGATTTTTTG

32、TGGTTTTTTGCAGTTTTTCACGATTTTTTACGGTTTTTTCACGGTTTCGATATCGGAGGAGAGAGAAATATACCGATTACGGAGGAGAGAGAAAAATATCAGCCGATATTACGGTTAAACCGATTTTTAAATCCCTGGTGTGGAGTCTATAAACATGTGACGTGAAAATTCGACACTAAGTGTTTCTTCAGAGAAGCTTGATCAATCCAGTTGACCAATTAATGATTAAGATATCAAAATTCATTTAATTTGAATTTTATGAACTCCGGAACTAATTTTAAGTGAAAAGTGTATAATTTT

33、GAGTTTCAAAAATCATACCTAAATAATTAAGAGAGAATGTTATTTTTCTTTAAATGTTTCGGTACAATTTTTTAAGTCTAAAATTATACGTTTTTCACTTAAAATTATTATCGAAATTCATAATATTAAGAGTAGATAAATTTTGATAACTTATTTGTAAAATCGATCAATAAACAACCTCATTTAAAAATCCCTCTCTACACCCTAGACTGTAATAAATTTAAATATAAGAGATTACAATACGATAAATCAAA TTATATTATTGAAAGATFAAACTCAAGTTAATTTJTTTTGTTTTC

34、AATTTTTACAGTATAAA AATTGTAATGAAAATTAGTTTAATTAAAATTTTTAAGAAACTTTCTCAATTCAAAATAATG TCTATTAATGAAGTAACTTCTAGATTGGTCAAAAATCAAAAGCAGAAATTTGGCAGGTA AATATCCCGCCTCCCAATGCAGGATTGATAATATAAAAAAATAAAGCTACTATTAAAGCGGTGCTACAATTGTACAACGTCCATTGCTGAACCATTTCCAGCCAACCGTCCGGGAGAAAAT TTGTCATCGGTGTAGTTGGTTCCCATATTCTCTCATTT

35、AAAGCCCAACCACCTCCTTGTTCC CTTTCCCCGTCCCTATATAACAACCATCACCAACTCAACTTCCCACCGTCAAAAATCAATC TTCTTCTTCACCGGTAACGTTGCAATTTGTTGCAGTAACAGAGTGTGACTGAGTAAGTAAGCGGAGCpLTP4pro :ATTACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCAGTAATACCACCGAGAATTTTGGTCTGTGAGAGGAGACAAGTGTGAGAGAAAATTAGAAAGAGAGGGACGAATTTGTGAGGTGGAGAGAG ATTTGTAATCTATATCCCA

36、TTTGGAATTAGTGAAACTCTCCGGTTGTTATCTGTGGACAG GAGCCTCGGTCGAGCTACGTTAAATTCAAGTGTTGATTGTGGATTGATTGTTTCCTTCAT TGGTTTGATTTACTGCCACTGATTGAATTGGAGATTAAATCCCAATACAAATTTTCTAAT CTATAGATAAAACTATGAATTCGAAAAGTAGCCCCTAATATTTAAGATGGACACTTTTTAAGGTGCATTTACTTAAAAAAAATCACTATTAAAAAAATAACGTGAGGTTCGTATCAACTACTTGAAATAAAGTAAA

37、TTTAAAATTTAAAACTGATGAATATGCTTTTCATTCAAGAGTTAAGGTGCCAAATTAGAACCTGATCAGCTCAAATTAAGTTCTGTGATGGTCAGAAGAA ATTGGTCGGTTCATGAGAAAGGACTATTTCTATTCACACACGGATAGAAAAGAGTTGAG AAATGAGTGCCAATTTGTCAAAAAGCAGGCCACTTCCACACTCATTGAATTAAAGCAAA TGCAGTTAGGTGGCCACTTGTCTTCTTCACTCACTATATTATTCTTTAGAGAGGTTACAA CACATGAGAGAGAGAAAC

38、AGAAAAAAGCCTCATTAAAGGAAGAAGAAGAAGCAGTAGAAGCAGAGAGAAGAAGGGAAAGGAAAAGGAGAAATAGAAGATTCTCTTCAATTCTCTG TGAAATCCATCAA启动子的生物信息学分析通过 PLANTCARE (plant cisacting regulatory elements, http: / /www.bioinformatics. psb. ugent. be /webtools/plantcare /html) 对获得的 CpLTP3pro, CpLTP4pro启动子进行分析，结果表明这两个启动子的转录因子结合位点均很多，

39、 其调控特性比较复杂(详见表6-2和图6-5)。TATA-box是RNA聚合酶II结合位 点，保证转录的精确起始，并调控上游激活蛋白,CpLTP3pro和CpLTP4pro启动子 都具有多个TATA-box CpLTP3pro在翻译起始密码子上游-62bp、-70bp、-166bp、 -318bp等21处均含有TATA-box CpLTP4pro启动子在翻译起始密码子上游-28bp、 -52bp、-293bp、-382bp 等 15 处均含有 TATA-box CpLTP3pro 和 CpLTP4pro 启动 子上游都具有CAAT-box但CpLTP3pro包括的数量较少，仅分别在-24bp、

40、-197 bp、 -425 bp 处有 3 个 CAAT-box，CpLTP4pro 则在-97 bp、-116 bp、-134 bp、-211 bp 等23处都具有CAAT-bo% CAAT-box主要控制着转录起始的频率，并增强转录， 其转录激活作用具有双向性，作用距离不定，是启动子、增强子区域常见作用元 件，主要转录激活因子有NFI、CTF1、CTF2、CTF3等多种蛋白。两个启动子 都拥有多个光应答元件，如ACE、GA- MOTIF、I-box等。另外还发现了这两个启 动子都具有很多与植物非生物胁迫相关的响应元件，如共同拥有的 ABRE、 G-BOX、HSE 以及 CpLTP4pro

41、所特有的 GARE-MOTIF、TATC-BOX、MBS、 TC-RICH REPEATSo这与植物非特异性脂转移蛋白所具有的抗多种非生物胁迫的 功能相一致。同时发现，CpLTP3pro启动子还具有与细胞周期调控有关的顺式调 控元件MSA-like和胚乳表达必须的顺式调控元件Skn-1_motif，这些在分离到的 CpLTP4pro中没有发现。表6-2启动子区的调控元件分析Table 6-2 Cis-acting regulatory elements analysis of twopromoter sequences编号位点名称数量序列位点功能No.Site nameAmountSequen

42、ceFunction of siteCpLTP3pro1AAGAA-motif1GGTAAAGAAA燕麦中发现，功能未知2ABRE2GACACGTGGC脱落酸应答顺式调控元件3ACE1ACGTGGA光应答元件4ATCT-MOTIF1AATCTGATCG部分光应答元件保守序列5Box II1CCACGTGGC部分光应答元件6Box II1TCCACGTGGC部分光应答元件6CAAT-BOX3CAATT 或 CAAT启动子、增强子区域普通顺或 CAAAT 或 CCAAT式作用元件7CCAAT-box1CAACGGMYBHv1结合位点8G-BOX7TAACACGTAG光、厌氧生活和ABA的应答元件；

43、与花特异表达有关；受光和紫外线诱导调控9GA- MOTIF1ATAGATAA部分光应答元件10GATA- MOTIF1GATAGGG或部分光应答元件也是AAGGATAAGGASF-2结合位点11GT1- MOTIF2GGTTAAGT-1结合起关键作用与光应答有关元件12HSE1AAAAAATTTC热应答元件13I-box2GATAAGATT部分光应答元件14MSA-like1TCCAACGGT与细胞周期调控有关的顺式调控元件15Skn-1_motif1GTCAT胚乳表达必须的顺式调控元件16TATA-BOX21核心序列TATA转录起始处是启动子核心元件17rbcS-CMA7a1GTCGATAA

44、GG部分光应答元件18circadian1CAANNNNATC昼夜节律顺式调控元件CpLTP4pro15UTR Py-rich stretch1TTTCTTCTCT提高转录水平顺式作用元件2ABRE1GACACGTGGC脱落酸应答顺式调控元件3ARE1TGGTTT厌氧诱导的必须顺式调控元件4ATGCAAAT motif1ATACAAAT与TGAGTCA序列相关的顺式调控元件5CAAT-BOX23CAATT 或 CAAT启动子、增强子区域普通顺式作用元件或 CAAAT 或 CCAAT6CAT-BOX3GCCACT分生组织表达顺式调控元件7G-BOX2TAACACGTAG光、厌氧生活和ABA的应答

45、元件；花特异表达有关；受光和紫外线诱导调控8GA- MOTIF2ATAGATAA部分光应答元件9GARE-MOTIF1AAACAGA赤霉素应答元件10GATA- MOTIF1GATAGGG或部分光应答元件也是AAGGATAAGGASF-2结合位点11GT1- MOTIF2GGTTAAGT-1结合起关键作用与光应答有关元件12HSE2AAAAAATTTC热应答元件13MBS1TAACTG与干旱相关的MYB结合位点14TATA-BOX15核心序列TATA转录起始处是启动子核心元件15TATC-BOX1TATCCCA赤霉素应答元件16TC-RICH REPEATS1ATTTTCTTCA胁迫相关应答元

46、件17chs-CMA1a1TTACTTAA部分光应答元件18circadian1CAANNNNATC昼夜节律顺式调控元件CpLTP3proCAAT-hgCGTCA-motifSkn-1 motifTC A-elementTGACG-mothGT 1-mom,6-5 nsLTPTCCACCT-motifA-boxG-box GT1-motif J HSELTR MBS MB SI- 一图阳ch蜡梅区芸基因启动子或陷和刽处坚独携列分析gene promoter CpLTP3pro and CpLTP4pronucleotide sequence analysis-Eiox G-box GA-mot

47、if GAItE-motif GATA-motifI circadian克隆载体pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro的构建重组质粒pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro分别经BamHI和Hindlll双酶切 鉴定，分别切出了约1200bp和800bp大小的预期目的片段和约1500bp和2100bp大小 的载体片段（如图6-5）。进一步PCR扩增pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro的目 的片段，得到了预1200bp和800bp大小的片段（如图6-6）。证明CpLTP3proK CpLTP4pro片段已插入pMD19-T中，克隆载体p

48、MD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro 构建成功。Fig.6-6 The identification of pMD- CpLTP3pro and pMD- CpLTP4pro bydigesting withBamH I& HindIIIA： pMD- CpLTP3proB: pMD- CpLTP4proM: Marker(DL2000) ； 1:cloning vector plasmidM132000bp：2GClbp10褊WOObp750bp;5Mp图6-7 克隆载体中目的片段M: Marker(DL2000) 1:克隆载体质粒pMD- CpLTP3pro； 2:克隆

49、载体质粒pMD- CpLTP4pro；3：阴性对照Fig. 6-7 Identification of CpLTP3pro and CpLTP4pro by PCRamplication in cloning vectorsM: Marker (DL2000); 1 pMD- CpLTP3pro; 2: pMD- CpLTP4pro; 3: blank6.3.6 植物表达载体pBI121- *7P3pro和pBI121- CpLTP4pro的构建重组质粒pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro经BimH I和HindI口双酶切 鉴定，分别切出了约1200bp和80

50、0bp大小的预期目的片段和约12kb大小的载体片段 (如图6-8)。进一步PCR扩增pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pr。的目的片段， 也分别得到了预期约1200bp和800bp大小片段(如图6-9)。证明CpLTP3proP CpLTP4pro 片段已插入 pBI121 中，表达载体 pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro构建成功，表达载体结构见图6-10。M 1密M12320p图6-9表达载体中目的片段的PCR验证2Q0bp l.QObp1000p750bp.SOObp图6-8 表达载体pBI121-CpLTP3pro和pBI

51、121-CpLTP4pr o 的酶切验证M: Marker(DL2000)1:表达载体质粒pBI121-CpLTP3pro2:表达载体质粒pBI121-CpLTP4proFig.6-8 The identification of pBI121- CpLTP3proM: Marker(DL2000)1:表达载体质粒pBI121-CpLTP3pro2:表达载体质粒pBI121-CpLTP4pro3：阴性对照Fig.6-9 Identification of CpLTP3pro and andpBI121- CpLTP4pro by digesting with BamHI&HindIIICpLTP

52、4pro by PCR amplication.Marker(DL2000) 1： pBI121- CpLTP3pro ；Marker(DL2000) 1： pBI121- CpLTP3pro ；2:pBI121-CpLTP4pro2:pBI121-CpLTP4pro； 3:blankBamHI HindlllNos-ter GUS CpLTF3pro/ NptllCpLTF4pro图 6-10 植物表达载体 pBI121- CpLTP3pro 和 pBI121- CpLTP4proFig.6-10 The construction outline of plant expression ve

53、ctorpBI121-CpLTP3pro and pBI121-CpLTP4pro含植物表达载体质粒pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro农杆菌 LBA4404的获得分别用2 g pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro质粒转化农杆菌LBA4404, 挑单菌落活化，参照CpLTP3pro和CpLTP4pro基因的扩增条件，PCR扩增目的基因， 分别得到了预期1200bp和800bp左右大小的片段(图6-11)，根据PCR结果筛选到阳 性转化子。M123456789102000bplOOObp750bp500bp200bp lOObp

54、图6-11转化农杆菌LBA4405中目的片段的PCR验证M: M: Marker（DL2000） ； 1-4:随机挑选的pBI121- CpLTP3pro质粒转化的LBA4404;5-8:随机挑选的 pBI121- CpLTP4pro质粒转化的LBA4404； 9:未转化的LBA4404 （阴性对照）；10:水（空白对照）Fig. 6-11 Identification of CpLTP3pro and CpLTP4pro by PCR amplicationin transformed LBA4404M: DL2000 marker; 1-4: Random selected pBI121-

55、CpLTP3pro transformed LBA4404 single thalli ;5-8: Random selected pBI121-CpLTP4pro transformed LBA4404 single thalli 9: Untransformed LBA4404（ Negative control）;10:H2O:Water served as model;用碱裂解法大量提取PCR结果阳性的LBA4404菌液的质粒，用HindIII和 BamHI做双酶切，得到了预期1200bp和800bp左右大小的片段（图6-11），说明 表达载体质粒pBI121- CpLTP3pro和p

56、BI121- CpLTP4pro成功转入农杆菌 LBA4404。图6-11转化农杆菌LBA4404中目的片段的酶切验M: Marker（DL2000） ； 1：载体质粒 pBI121- CpLTP3pro （农 杆菌 LBA4404 中） 2:载体质粒 pBI121- CpLTP4pro （农 杆菌LBA4404中）Fig. 6-11.Identification of pBI121-CpLTP3pro and pBI121- CpLTP4pro by digesting with HindIII&BamHI in transformed LBA4404M: Marker（DL2000）; 1

57、: Expression vector pBI121- CpLTP3pro in transformed LBA4404;2: Expression vector pBI121- CpLTP4pro in transformed LBA4404;6.3. 8瞬时表达技术检测启动子活性GUS活性组织化学染色结果（图6-12）表明，不进行任何诱导的情况下，%乙沈3尸0和乙沈4尸0均表现出一定的启动子活性；在ABA、Nacl、PEG、4C、37C处理下，CpLTP3pro和CpLTP4pro可以启动GUS告基因的表达，其表达强度 略高于不进行任何诱导处理的情况；在GA3处理下，CpLTP4pro的启

58、动子活性明显 高于CpLTP3pro, 这与CpLTP4pro含有赤霉素诱导相关的调控元件TATC-BOX、 GARE-MOTIF而CpLTP3pro不含有任何赤霉素诱导相关调控元件的生物信息学分 析结果相吻合。图6-12 CpLTP3pro和CpLTP4pro启动子的瞬时表达检测Fig. 6-12 Detection of transient expression of CpLTP3pro and CpLTP4pro promoters66.4讨论虽然用随机引物进行染色体步行的技术提出较早，但是由于无法有效地控制 由随机引物引发的非特异性产物的产生，这种方法一直未能得到广泛应用，由LIU 等

59、提出的TAIL-PCR具有过程简单、快速省时、高效特异、直接测序等优点，则巧 妙地解决了这个问题。与其他PCR方法相对，TAIL-PCR在已知基因的未知侧翼序列的应用中具有 以下优点：（1）方法简单，PCR前既不需要特殊的DNA操作，反应后也不需要繁 琐的产物鉴定，仅仅进行琼脂糖电泳即可有效地证明产物的特异性，而其他PCR 方法在反应前需要对DNA进行纯化、限制性内切酶消化、连接和加尾等操作，反 应后还需要对产物进行Southern杂交、引物标记和延伸等繁琐耗时的鉴定。（2） 高特异性。TAIL-PCR的特异引物的解链温度要比任意兼并引物高出10C；任意兼 并引物较短，且具有较低的解链温度；交

60、替进行的热不对称巢式PCR反应加上不 同特异引物与兼并引物的组合使特异产物大大增加，非特异产物得到高倍稀释， 产物可直接测序。（3）快速省时，整个反应仅需1天就可以完成。本实验中用于克隆启动子的TAIL-PCR方法是LIU等人在传统的TAIL-PCR方 法基础上经过改良的hiTAIL-PCR280，它结合利用TAIL-PCR和抑制PCR的原理， 预扩增反应中利用5带尾巴的高简并倍数的LAD引物在靶序列上创造结合位点; 两端均为LAD引物和两端均为特异引物产生的较短的非特异产物（300 bp）的扩 增受到抑制，第一轮TAIL-PCR中利用5带尾巴的第一轮特异引物抑制较短的特 异产物的扩增，并利用