保健食品的抗氧化功能

1、保健食品的抗氧化功能作者:日期:抗氧化功能保健食品的功效成分及检测一、概述自由基是指含有未配对的电子的原子、分子或基团，由于自由基中含有未成对电子，具有配对的倾向，具有很高的活性。自由基若要稳定必须向邻近的原子或分子夺取电子而使自己的电子成对，但也因此使得电子被夺的那个原子或分子成为新的自由基，引发连锁反应，这个过程就是“氧化”。自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中，人体内存在少量的氧自由基，不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物。自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞，会

2、造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、关节炎等疾病都被认为与自由基过多相关。抗氧化剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。抗氧化剂的种类繁多,可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类抗氧化剂一般为抗氧化酶，主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等。非酶类抗氧化剂一般包括黄酮类、多糖类、维生素C、维生素E、卩-胡萝卜素等物质。它们是能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。国家食品药品监督管理局（SFDA）已批准

3、具有抗氧化功能的常用原料有：维生素A、维生素C、维生素E,硒,OPC（低聚原花青素）,SOD（超氧化物歧化酶），辅酶Q10，DHA，茶多酚，卩-胡罗卜素，牛磺酸，螺旋藻等。随着年龄的增长，机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降，从而减弱了对自由基损害的防御能力，使机体组织器官容易受损，加速了机体的衰老，引发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生，可以人为地由膳食补充抗氧化剂,从而达到防御疾病、延缓衰老的目的。二、主要功效成分介绍（一）酶类抗氧化剂（Enzymesantioxidant）1、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）从1938年Marni等人首次从牛红血球中分离

4、得到超氧化物歧化酶开始算起,人们对SOD的研究己有七十多年的历史。969年IrwinFridovich和JoeMcCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶，英文简称为SOD3。(1)性质及结构SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物,微生物等。S0D是一类含金属的酶，按其所含金属辅基不同可分为含铜锌(分子中同时含有Cu和Zn)、含锰或铁(分子中含有锰或铁)和含镍(分子中含有镍)3种(图1、图2)。含铜锌金属辅基的CuZn-SOD是主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植物的叶绿体基质

5、、类囊体内以及线粒体膜间隙中。广泛存在于动物血液、牛肝、猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织中，是目前应用最广泛的一类酶。大肠杆菌和其他一些原核细胞生物中一部分含有Fe-SOD,一部分含有Mn-SOD,而另外一些两种抗氧化酶都含有。图错误!未定义书签。CuZnSOD结图错误!不能识别的开关参数。Mn-S0构图D结构图理化及生物学特性SOD是一种酸性蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应较其他蛋白酶稳定。其酶活性既取决于蛋白质，还取决于结合到活性部位的金属离子。SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，对氧自由基有强烈清除作用，特别对于超氧阴离子(O2),SOD可将其催化歧化而生成H2O2

6、和02,故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异酶。SOD的生理功能及应用破坏作用，减轻或延缓甚至治愈某些疾病，延缓因自由基损害生命大分子而引起的衰老现象，如延缓皮肤衰老和老年斑的形成等；同时SOD还能提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力；增强人体自身的免疫力;清除放疗所诱发的大量自由基；消除疲劳等生理功能。SOD在医疗上对治疗关节炎和类风湿性关节炎疗效显著。此外,SOD对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖尿病、贫血等疾病均有疗效。作为一种体内自由基去除剂SOD能保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭O2-的SOD在食品方面可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂，有良好的抗衰老、抗炎、

7、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国内外已把SOD作为食品添加剂应用到多种食品中。同时还可用富含SOD的原料加工制成功能性食品,如大蒜饮料、刺梨SOD汁等。(4)生物安全性超氧化物歧化酶(SOD)目前世界范围内大都从动物血液中提取，不但代价昂贵，而且动物性SOD有排他性、不易常温保存等缺点，同时存在艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潜在危险。2、过氧化氢酶(catalase,CAT)(1)性质过氧化氢酶存在于细胞的过氧化物体内，可以催化氧化氢分解成氧气和水，是生物防御体系的关键酶之一h2o浓度越高，分解速度越快。22过氧化氢酶是在1811年被过氧化氢(HO2)的发现者泰纳尔(Louis22Jacq

8、uesThenard)首次发现。1900年，OscarLoew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“Catalase”，即过氧化氢酶，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。1937年，詹姆斯耳萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶，并在次年获得了该酶的相对分子质量。1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。1981年其三维结构得以解析(图3)。图错误不能识别的开关参数。过氧化氢酶结构图(2)生物学功能过氧化氢酶广泛存在于能呼吸的生物体内，如植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢

9、酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢。近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。3、谷胱甘肽过氧化物酶(gutathioneperoxidase,GPX)性质谷胱甘肽过氧化物酶为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是第一个在哺乳动物体内发现的含硒酶(图4),它于1957年被Mills7首先发现，1973年由Flohe和Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系。图错误不能识别的开关参数。谷胱甘肽过氧化物酶结构图(2)生物学功能：谷胱

10、甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进日2。2的分解,从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。(二)原花青素1、结构与性质原花青素是由不同数量的儿茶素(catechin)或表儿茶素(epicatechin)结合而成。最简单的原花青素是儿茶素、或表儿茶素、或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二五原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化

11、剂。一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物。原花青素一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。2、生物学功能8,9原花青素是当今医学界发现的最安全高效的抗氧化剂、自由基清除剂和紫外线吸收剂，广泛应用于保健食品、药品和化妆品。其抗氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍，它能有效清除体内多余的自由基，保护人体细胞组织免受自由基的氧化损伤，具有抗心血管疾病、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、抗疲劳、改善视觉功能等药理作用，可用于治疗动脉粥样硬化、高血压、冠心病、肿瘤等疾病。通过三条途径保护人体的血液循环系统：清除血液中存在的氧自由基；帮助机体阻止氧自由基的生成；增强血管壁的完整性阻抑胶

12、原酶和弹性蛋白酶对结缔组织的降解作用，因而有利于保持皮肤的弹性，发挥抗皮肤衰老的功效。能增强眼底视网膜毛细血管和四肢末梢毛细血管的微循环。通过维持血管的健康和改善微循环，使各器官和组织获得较充足的血液供应。(5)能增强免疫功能，表现在花青素提高喂酒精的小白鼠和感染逆转录病毒的小白鼠细胞介素2的免疫应答能力。(6)花青素还可增强维生素C的功效，延长维生素C在人体内发生功效的时间。(7)花青素在水中的溶解性非常好，口服后吸收好，进入人体内起效快，而且作用时间持久。4、安全性：Masquelie教授和许多科学家利用花青素，已经做了多年的各种临床、化验、毒性和药物动力学的研究。多种动物实验和实验系统研

13、究的结果证明，花青素无毒、无致突变性、无致癌性、无致畸胎性、无致敏性，因此花青素是安全的。(三)类胡萝卜素(Carotenoids)类胡萝卜素(Carotenoids)是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中lo-il。类胡萝卜素可分3类：胡萝卜素，羟类化合物，特点是溶于石油醚。多数都具有CH的化学实验式。最常见的有蕃茄红素和a,p,y-胡萝卜素。叶黄素，亦称胡萝卜醇,是胡萝卜素的非酸性氧衍生物。含氧基团有羟基、酮基、醚基、环氧基和类咲喃基。常见的有隐黄质、玉米黄质、叶黄素、辣椒红、辣椒玉红素、虾青素、虾红素、海胆烯酮、蒲公英黄质、新黄质

14、、柠黄质、紫菌红素丁等。类胡萝卜素酸，胡萝卜素的羧酸衍生物，能溶于碱溶液。例如：藏花素、胭脂树橙和红酵母红素等。1、番茄红素(Lycopene)(1)性质:番茄红素又称屮-胡萝卜素，属于异戊二烯类化合物，是类胡萝卜素的一种。番茄红素(lycopene)是一种脂溶性不饱和碳氢化合物,是类胡萝卜素的一种，分子式为C40H5点，相对分子质量536.85,熔点174C(反式)，与P胡萝卜素是同分异构体。分子结构见图7，番茄红素难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂12。生物学功能:研究发现，番茄红素具有优越的生理功能，它不仅具有抗癌抑癌的功效，而且对于预防

15、心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统以及延缓衰老等都具有重要意义。番茄红素具有抗氧化、抑制突变、降低核酸损伤、减少心血管疾病及预防癌症等多种保健功能。抗氧化延缓衰老。番茄红素抗氧化能力是维生素E的100倍，维生素C的1000倍。是自然界最强的延缓衰老的抗氧化剂。防癌抗癌，辅助抑制肿瘤。番茄红素能清除导致细胞癌变的自由基，达到预防的作用。对已形成的肿瘤，可促进细胞间隙传输信号，接触抑制、分化诱导癌细胞。前列腺保健，提高男性生育能力。调节血脂，预防心脑血管疾病。抗辐射，美容美肤。乳房子宫保健。番茄红素可促进女性乳房健康发育，减少乳腺癌发生几率。(3)生物安全性：番茄红素雌、雄小鼠LD

16、50均大于20.0g/kg.属无毒物质；Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性；大鼠30天喂养试验结果显示番茄红素30天喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用】3。2、虾青素(Astaxanthin)(1)性质及结构:虾青素是-种端基为酮基类胡萝卜素，化学名称为3,3二羟基-4,4二酮基-卩,P-胡萝卜素，分子式为C40H53O4，又名虾黄素，虾黄质，龙虾壳色素，是一种非维生素A源类胡萝卜素14,分子结构见图8。虾青素是从河螯虾外壳，牡蛎和鮭鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，在体内可与蛋白质结合而呈青、蓝色。有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病作用】4。图错误不能识别的开关参数。虾青素

17、的分子结构图生物学功能：虾青素是类胡萝卜组的一种。也是类胡萝素合成的最高级别产物，卩一胡萝卜素、叶黄素、角黄素、番茄红素等都不过是类胡萝卜素合成的中间产物，因此在自然界,虾青素具有最强的抗氧化性15。主要功能有:抗癌作用:虾青素对人大肠癌SW116细胞的增殖有明显抑制作用，对膀胱癌、肝癌、口腔癌、肺癌和由紫外线引起的皮肤癌有一定的抑制作用。抗氧化作用:虾青素具有超强的抗氧化作用，其抗脂肪氧化的能力比卩-胡萝卜素高10倍，比维生素E高550倍，是OPC的20倍,故称为超级抗氧化剂。虾青素能增强抗体反应和增强体液免疫的功能。对心血管系统有显著的保护作用。虾青素极易通过血脑屏障，故能有效地预防与年龄

18、相关的视黄斑退化和中枢神经系统疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤)。生物安全性：人分别服用3.6mg/d、7.2mg/d、14.4mg/d剂量的虾青素都没有出现不良反应，而且血浆LDL氧化的速率随剂量增加而减慢。研究表明虾青素无毒副作用16。3、叶黄素(Xanthophylls)(1)性质及结构：叶黄素是a-胡萝卜素的衍生物，分子式：C40H56O2,相对分子质量:568.85。它含有二个不同的紫罗酮环：卩-和&紫罗酮环，在各紫罗酮环的第3个碳原子上存在一个功能性羟基。在C23、C23和C26处有三个不对称中心，因此理论上有8种立体异构体17,分子结构见图9。叶黄素又名“植物黄体素”，在

19、自然界中与玉米黄素(Zeaxanthin)共同存在。叶黄素与玉米黄素是构成玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要组分，也是构成人眼视网膜黄斑区域的主要色素18-19。图错误不能识别的开关参数。叶黄素的分子结构图(2)生物学功能：叶黄素能抑制活性氧自由基的活性，阻止活性氧自由基对正常细胞的破坏。叶黄素可通过物理或化学淬灭作用灭活单线态氧，从而保护机体免受伤害，增强机体的免疫能力。另外叶黄素还能改善老年人视力衰退；预防老年性黄斑变性所导致的盲眼病；保护由日光、电脑等所发射的紫外线所导致的对眼睛和视力的伤害作用;降低白内障的发生率；减轻体内和皮肤退行性老年斑的形成；调节血脂；延缓动脉硬化；抗癌作用等

20、作用。(3)生物安全性：叶黄素雌、雄小鼠经口LD均大于21.5mg/kg,根据急性毒性(LD)剂量分级标准，属无毒级。遗传毒性试验(Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验)均为阴性，表明叶黄素无致突变作用。在大鼠30d喂养试验中未见动物健康状况、血液学、血液生化学和器官组织形态的异常变化。(四)维生素类(Vitamins)1、维生素E(VitaminE)(1)性质及结构:维生素E(VitaminE)是一种脂溶性维生素，又称生育酚,是最主要的抗氧化剂之一20。化学式：C29H5。02；相对分子质量:430.69;分子结构见图8;外观潢色油状液体;密度：0.950g/cm3；熔点：2.5

21、3.5C;沸点：200C220C。图错误不能识别的开关参数。维生素E的分子结构图生物学功能：维生素E能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加;使女子雌性激素浓度增高,提高生育能力，预防流产,还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末稍血管扩张,改善血液循环,预防近视发生和发展。维生素E可清除自由基，防止油脂氧化和阻断亚硝胺的生成，故在提高免疫能力，预防癌症等方面有重要作用，同时在预防和治疗缺血再灌注损伤等疾病有一定功效21。生物安全性:美国和欧盟有各自的维生素E安全评价体系。美国采用的是HACCP评价体

22、系,将动物试验中高剂量维生素E造成的出血(小鼠的出血部位为:肠道、尿道、脑膜和眼眶)作为最高耐受剂量的关键控制点。以500mg/(kgBWd)为LOAEL(最低有害作用水平)，并通过安全系数的换算，得出成年人每日维生素E的可耐受最高摄入量为1000mg/d。人的NOAEL(无明显副作用水平)为540mg/d，通过安全系数换算，成年人每天摄入维生素E的可耐受最高摄入量为270300mg/d。2、维生素C(VitaminC)(1)性质及结构:分子式：C6Hg06;相对分子质量：176.12；分子结构式见图11;酸性，在溶液中会氧化分解；外观:无色晶体；熔点：190C192C;紫外吸收最大值：245

23、nmo维生素C又称为抗坏血酸,在自然界中存在还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗坏血酸两种形式。抗坏血酸通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，在转化的过程中达到清除0-、0H、R00等自由基的作用。维生素C2具有强抗氧活性，能增强免疫功能、阻断亚硝胺生成、增强肝脏中细胞色素酶体系的解毒功能。人体血液中的维生素C含量水平与肺炎、心肌梗塞等疾病密切相关22。图错误不能识别的开关参数。维生素C的分子结构图生物学功能:维生素C的主要作用是对抗游离基，有助于防癌，降低胆固醇，防止坏血病;提高免疫力，预防心脏病、中风，保护牙齿和牙龈等。另外，坚持按时服用维生素C还可以使皮肤黑色素沉着减少。生物安全

24、性：维生素C的毒性很小，但服用过多仍可产生一些不良反应。有报告指出，成人维生素C的每日摄入量超过2g，可引起渗透性腹泻。当每日摄入量小于1g时，一般不引起高尿酸症，当超过lg时，尿酸排除明显增加。研究发现，每日服用4g维生素C，可是尿液中尿酸的排出量增加一倍，并因此而形成尿酸结石增多。过量的维生素C还可引起子宫颈粘液中糖蛋白二硫键改变，阻止精子的穿透，造成不育。妊娠期服用过量的维生素C,可能影响胚胎的发育。3、维生素A(VitaminA)(1)性质及结构：维生素A主要存在与动物肝脏、血液和眼球的视网膜中,分子式C2qH30o；熔点：64c；维生素A2主要在淡水鱼中存在，分子式C2oH28O；熔

25、点:17C19C。维生素A是人体必需的13种维生素之一，是一种脂溶性抗氧化剂，在人体中可以维持视力并且促进骨骼成长di。(2)生物学功能：维生素A有一定的抗氧化作用，可以中和有害的游离基；维持视觉,维生素A可促进视觉细胞内感光色素的形成；促进生长发育，视黄醇也具有相当于类固醇激素的作用，可促进糖蛋白的合成；维持上皮结构的完整与健全;加强免疫能力；维生素A有助于维持免疫系统功能正常，能加强对传染病特别是呼吸道感染及寄生虫感染的身体抵抗力。生物安全性:长期或大量服用维生素A，可引起中毒反应。成人一次用药超过50万单位，或儿童超过30万单位，可引起急性中毒，表现为头痛、烦躁、多汗、食欲不振等。不论成

26、人还是儿童，连续用药超过6个月，皆可引起慢性中毒。三、主要功效成分的检测方法综述1、免疫学方法将GPX3抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中依次加入标准品和标本，其中的GPX3与连接于固相载体上的抗体结合，洗板之后加入生物素化的GPX3抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素,再次彻底洗涤后加入底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GPX3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，计算样品中谷胱甘肽过氧化物酶的浓度。2、分光光度法细胞色素C还原法24(McCord法)测定SOD：pH7.

27、8，0.3mol/L磷酸钾缓冲液0.5mL(含1X10-4mol/LEDTA),6x10-5mo1/L氧化型细胞色素C液0.5mL,0.3mmol/L黄嘌吟液0.5mL,1.3mL重蒸水，在预保温10min，最后加入1.7x10-3u/mg.port的黄嘌吟氧化酶0.2mL,并立即计时，速率变化在2min内有效，控制黄嘌吟氧化酶浓度,使其在550nm的吸光度为0.25/min，测定SOD活性时，加入0.3mLSOD被测液，重蒸水相应减少到1.0mL，根据抑制程度，计算活性。邻苯三酚自氧化法25(简称Mark1und法)测定SOD:邻苯三酚发生自氧化测定:50mmol/L的Tris-HC1(pH

28、8.2)缓冲液3mL,预热至25C，加入10吐50mmol/L的邻苯三酚，充分摇匀,以缓冲液做空白对照，每隔半分钟测一次吸光度。同样条件，加入10吐待测SOD液，读取其吸光度。羟胺发色法3测定SOD：将10mmo1/L邻苯三酚，10mmol/LEDTA-Na2,40mmol/L盐酸羟胺和重蒸水按1:l：4：4配制反应液，将90mg/L氨基苯磺酸和1.5mg/LN-甲萘基二氨基乙烯按1:1配成显色液，取0.95mL0.1mol/L的Tris-HC1和0.05mLSOD待测液，再加0.1mL反应液，室温反应15min,再加2.0mL显色液，550nm处比色。钼酸铵比色法测定CAT：过氧化氢酶(CA

29、T)可催化H2O分解生成HO和222o2,体系中残留的h2o2再与钼酸铵作用生成黄色化合物，反应在很短时间即可达到平衡，并至少可稳定60min,其生成的黄色化合物在405nm处所呈现的吸光度取决于h2o2和钼酸铵的浓度,根据过氧化氢酶分解h2o2的多少间接测定其含量。改良比色法测定CAT：CAT分解H2O2的反应可通过加入醋酸重铬酸钾而迅速中止，剩余的HO与醋酸重铬酸钾在加热条件下反应生成铬酸醋酸钾，在波22长570nm610nm进行比色测定铬酸醋酸钾的生成量，可反映比。？的含量。谷胱甘肽过氧化物酶测定通常采用二硫代二硝基苯甲酸法，其原理是GSH和二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)作用生成5-硫代

30、二硝基苯甲酸阴离子。该离子呈现较稳定的黄色，在412nm测定其吸光度，即可计算出GSH的量，以单位时间内GSH减少量来表示GSH-Px活力。GST具有催化GSH与1氯一2,4-二硝基苯结合的能力,GSH+C6H3(NO2C1(1-巯基一2,4-二硝基苯)+HC1,在一定时间内，活性高低与GSH的减少量呈线性关系。由于上述反应在非酶条件下仍能进行，故计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。杨万政等囚用分光光度法测定了沙棘油中类胡萝卜素的含量，检测波长为445nmo张英宣等28采用改进的分光光度法测定了胡萝卜中类胡萝卜素的含量。在5.00mg/kg100mg/kg浓度范围内,平均回收率

31、为99.0%,相对标准偏差小于5%。丁贵平等29建立了分光光度法测定保健食品中微囊化卩-胡萝卜素,采用正交设计确定了提取卜胡萝卜素的最佳条件，样品经酶解，用氯仿提取后，转至环已烷溶剂中，在454nm波长下测吸收值，通过E值计算其含量。方法的回收率为92.5%96.6%,相对标准偏差为2.4%2.6%oJafarMuhammadEL-Qudah3o用分光光度法测定了约旦日常膳食中的总类胡萝卜素含量。EffatSour：等31用三阶导数分光光度法同时测定了花色素甙和卩一胡萝卜素，花色素甙和卩-胡萝卜素的测定波长分别为625nm和540nm,检出限分别为125yg/mL和6.25g/mLo分光光度法

32、是测定番茄红素的常用方法。番茄红素在不同的有机溶剂里均有类似的吸收峰，最大吸收峰的波长约为472nm484nm32,人们经常将样品溶解在石油醚或正己烷中，在最大吸收波长下用分光光度计测定溶液的吸光度，以此来表征番茄红素的浓度，用摩尔消光系数计算其中番茄红素的含量33-34。程杨35采用浸提法从试样中提取番茄红素，用苏丹I标准品代替番茄红素标准品，通过紫外分光光度法测定试样中番茄红素的含量。通过比较试验分析石油醚、乙烷、丙酮和氯仿4种不同有机试剂对番茄红素的提取效果，确定最佳提取工艺为:用甲醇洗脱试样中的黄色素，用氯仿作为提取溶剂提取试样中的番茄红素，提取率为4.459mg/g。郑丽丽36采用苏

33、丹N代替番茄红素做标准品制备标准曲线,在波长485nm处测定番茄红素含量，回收率99.09%,RSD2.0%。以苏丹红代替番茄红素作为标准品，绘制标准曲线，用以测定番茄红素的含量以及用石油醚或者正己烷为溶剂，在472nm比色测定其吸光度,用摩尔消光系数来计算其中番茄红素的含量。这两种方法不需要标准品，但其系统误差较大，同时不能排出卩-胡萝卜素等其他类胡萝卜素的干扰。张连富37从番茄红素及卜胡萝卜素的紫外吸收光谱的差异入手，以2%二氯甲烷为溶剂，以502nm为检测波长,建立了番茄红素的测定方法，避免了其他类胡萝卜的干扰并将其转化为用消光系数来计算的形式。尚德军国利用一种抽提装置建立了一种快速测定

34、番茄红素的方法，并与国家标准番茄红素测定方法GB14215-1993进行了比较。结果表明该方法与国家标准方法相比，测量结果偏高。马亚军等39建立了葡萄籽提取物中原花青素的硫酸高铈盐分光光度法，该方法是基于原花青素与Ce4+在强酸性介质中反应生成无色的Ce3+，通过测定黄色高铈盐的吸光度，间接测定原花青素的原理Ce4+在319nm波长处具有最大吸收。该方法的线性范围为0.12yg/mL10yg/mL,RSD为0.98%1.1%,回收率为97.2%102.8%,检出限为0.04pg/mL。傅武胜40建立了含葡萄糖提取物的保健品中原花青素的铁盐催化比色法，并对可能存在的干扰进行了探讨。溶液中原花青素

35、稀盐酸的水解作用和硫酸铁铵的催化作用下，转变为红色的花青素,550nm处比色测定。在26.00pg416.0卩g范围内，原花青素的浓度与吸光值OD550呈线性关系，最低检出限为4腿。3、荧光法Fe2+和比O在酸性介质中(pH2.5)经Fenton反应产生QH,QH与喹啉经22芳香羟基化反应，羟基化喹啉在碱性介质中呈现出很强的荧光(人尸360nm，久exm=440nm)，荧光强度的增量与H?O的量成正比。毛玉霞等4发现过氧化em22氢酶将H2O分解为H2O和o2,对Fenton反应有显著的抑制作用，进而抑制芳香羟基化反应，导致体系的荧光强度降低.荧光强度的降低程度与CAT活性有良好的定量相关性。

36、4、化学发光法化学发光法测定SOD：在25C试管中先加入0.6mLpH5.6磷酸盐缓冲液,0.1mL1mmol/LEDTANa溶液,0.1mLlmmo1/L黄嘌吟溶液,25ymol/L的测试管中再加10吐待测样本（对照管中加入10吐生理盐水，放入发光仪测试室），最后加入100yL黄嘌吟氧化酶应用液，启动反应。鲁米诺（lumino1）在一定条件下与HO及Co2+等金属离子共存时发22出强烈的蓝光，当样品中有CAT存在时，基质的H2O2将被分解，由H2O2所引起的化学发光强度减弱计算总CAT酶活性。5、薄层色谱法薄层色谱法测定维生素E只适用于a-E。试样经皂化，使维生素E游离，用乙醚抽提出不可皂化

37、物，用薄层层析法分离出a-E，使其与三氯化铁溶液反应，三价铁被还原为二价铁，二价铁与a,a-联氮苯反应生成铬盐，测定其显色深度,求出a-维生素E的含量。杨万兴等H3建立了高效薄层扫描法测定维生素E霜中维生素E含量的方法。以乙酸乙醋、乙醚、冰醋酸（7:3:0.2）为展开剂，采用双波长反封锯齿法，测维生素E时As=285nm,Ar=285nm。加样回收率为98.7%,RSD为2.5%。6、毛细管电泳法电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法。电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色（呈现棕色区带）也可采取SOD活性负染色（呈现无色透明区带）。根据凝胶上电泳分离的SO

38、D区带的着色深浅与面积大小,对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。AnaMafiaAdalid等44用毛细管电色谱法分析测定了番茄中的番茄红素和卩-胡萝卜素含量，方法的检出限和重现性分别为1.6yg/mL和7.2%，方法可以很好的应用于番茄及其制品中番茄红素和卩一胡萝卜素含量的测定。Herrero-Martinez等辽2用毛细管电泳法测定了蔬菜中的卩-胡萝卜素、番茄红素和叶黄素的含量，可以很好的应用于测定胡萝卜、番茄、菠菜和玉米中的卜胡萝卜素、番茄红素和叶黄素的含量。7、高效液相色谱法周林宗等45研究了固相萃取富集和预分离微柱高效液相色谱快速测定枸杞样品中类胡萝卜素的方

39、法，方法采用用二极管矩阵检测器检测，检测波长为450nm,枸杞样品中的几种类胡萝卜素在5min内可达到基线分离，方法标准回收率为95%103%,RSD为1.9%2.6%。章清等46建立血清中叶黄素、卩-胡萝卜素、番茄红素的高效液相色谱测定法，检测波长为450nm,叶黄素、番茄红素和卩一胡萝卜素的，回收率分别为97.98%102.80%、97.24%101.76%、98.56%100.4%,日内和日间RSD分别为2.26%和3.02%、4.34%和5.02%、1.81%和2.52%。标准曲线的线性范围为0.05pg/mL2.00pg/mLo张玉珍等47建立了虾青素的含量及有关物质的反相高效液相色

40、谱测定方法，检测波长为482nm,虾青素在6pg/mL36pg/mL范围内线性良好，检出限为11ng/mL，平均回收率为100%，RSD为0.29%oAminIsmail等48用高效液相色谱法测定了5种蔬菜在不同种植方式下维生素C、卩-胡萝卜素和叶黄素含量的变化。李国营等网建立了应用高效液相色谱法(HPLC)测定谷子种质资源中维生素E的检测技术，并应用统计学原理对方法的精密度、准确度、再现性等进行了较全面的考察和评价。利用该方法对400份谷子种质资源进行了鉴定、评价，并筛选出一批高维生素E含量的种质资源。刘胜辉等50用高效液相色谱法测定了几种水果中的维生素C,并研究了不同的色谱条件、不同的提取

41、液对测定结果的影响，结果表明:用0.25%的偏磷酸浸提样品以及作为流动相效果较好，测得Vc的保留时间为4.35min，回收率为92%98%，线性范围0.0001mg/mL1.68mg/mL。何优选等51建立了一种高效液相色谱测定沙田柚果肉中维生素C含量的方法。检测波长为265nm，线性范围40pg/mL320pg/mL，回收率为99.31%101.87%。谢志鹏等耳建立并应用了一种集高效液相色谱(HPLC)、流动注射(FI)和电化学发光三者优点于一体的HPLC-FI联用电化学发光分析新方法，方法基于将在线恒电流电解产生CIO-与Luminol构成了较强的化学发光体系，而维生素C对该化学发光体系

42、有抑制作用，与流动注射技术相结合。该方法在维生素C的浓度为1.0 xl0-8mmol/mL3.0 x10-6mmol/mL之间呈良好的线性，检出限达到3.0 x10-9mmol/mL,回收率93.6%106.8%。张云楚等g建立了高效液相色谱一示差折光检测法测定维生素C葡萄糖注射液含量的方法,维生素C和葡萄糖分别在0.10g/L1.00g/L和0.25g/L2.50g/L的浓度范围内呈线性，两者的平均回收率分别为100.2%与99.8%,RSD分别为1.5%与1.0%。GB/T22249-2008保健食品中番茄红素的测定34适用于作为主要功效成分添加于保健食品中番茄红素的测定。其方法原理是利用

43、番茄红素易溶于二氯甲烷等溶剂的理化特性，试样经焦性没食子酸-二氯甲烷溶液提取，定容，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，由紫外检测器检测,根据保留时间和峰面积进行定性和定量。当取样量1.0g时，定容至10mL,进样量10pL时，检出限3x10-4g/kg，定量限1x10-3g/kg。线性范围为0.200pg/mL20.0pg/mL。赵平娟55建立了番茄及其制品中番茄红素高效液相色谱法测定方法。样品经丙酮加石油醚(2：1)(含0.1%BHT)提取，色谱柱采用(4.6x250mm,i.d.5pm)，流动相为甲醇-乙腈一二氯甲烷(体积比25：70:5)，柱温为室温，检测波长为473nm，番茄红

44、素的保留时间为6min。在3mg/kg24mg/kg添加水平，回收率为87.8%99.9%，相对标准偏差为2.3%5.8%。黄声岚56健立了RP-HPLC法快速测定番茄红素粉剂中的番茄红素。该法采用WatersNovaPakC18(3.9mmx150mmid.4pm)，以甲醇：乙腈(80:20)为流动相，470nm为检测波长，测得番茄红素软胶囊中番茄红素的平均含量1.26%，RSD为2.5%；平均加标回收率97.7%，RSD为2.3%。张志强57探讨了HPLC法测定番茄红素的方法，结果表明最佳的色谱条件为流动相采用乙腈：四氢咲喃:二氯甲烷=85:3.4:1.6的体系、检测波长472nm,在此条

45、件下可很好的分离番茄红素，回收率96%102%。Ding-QiangLu58建立反相高效液相色谱法测定番茄红素微胶囊中番茄红素含量的方法。该法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为美国AlltechAlltimaC18(4.6mmx250mm，5pm)，流动相为甲醇-四氢咲喃-水(66：30:4),流速为1.5mL/min，检测波长为472nm。结果线性范围为3.6pg/mL18pg/mL，平均回收率为99.81%101.06%,RSD为1.12%1.83%。张丽薇39采用高效液相色谱法测定保健食品中的番茄红素(胶囊或片剂)。样品用水溶解破膜，以乙酸乙酯提取，用HPLC检测番茄红素的含量。本方法线性

46、范围为0.0yg/mL10.0yg/mL,最低检出浓度为0.1卩g/mL，加标回收率为98.36%104.8%,相对标准偏差为2.3%4.2%。方法操作简单,灵敏度高,线性范围宽。8、质谱法B.StephenInbaraj等用HPLC-DAD-APCI-MS法测定了枸杞中的类胡萝卜素及其酯的含量，方法测定了11种类胡萝卜素和7种类胡萝卜素酯。LiH等61用LC-APCI-MS法测定鱼子中的类胡萝卜素和维生素A的含量,同时方法还研究了测定过程中基质效应的影响。A.GarridoFrenich等62用LC-MS法测定了蔬菜水果中的维生素C和类胡萝卜素含量。四、功效成分检测方法(一)保健食品中超氧化

47、物歧化酶(SOD)活性的测定-修改的Marklund方法1、试剂A液:pH8.200.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-)盐酸缓冲溶液(内含1mmol/LEDTA2Na)。B液：4.5mol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmo1/L盐酸溶液，并定容至100mL。2、测定方法邻苯三酚自氧化速率测定在25C左右，于10mL比色管比色管中依次加入A液2.35mL,蒸馏水2.00mL,B液0.15mL。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率AA325(min-i)为0.060。样液和SOD酶液抑

48、制邻苯三酚自氧化速率按上述步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率为1/2AA25(min-1),即AA25(min-1)为0.030。SOD活性测定加样程序见表2。SOD活力(U/mL)=AA-AA“皿325325X100%AA32550%x4.5xxDV.(1)表错误未定义书签。SOD活性测定加样表试液空白样液SOD液A液/mL2.352.352.35蒸馏水/mL2.001.801.80样液或SOD液/yL20.020.0B液/mL0.150.150.15液体样品按式（1）计算:式中：U/mLSOD酶活力单位；AA邻苯三酚自氧化速率；325AA325样液或SOD酶液抑制邻苯三酚

49、自氧化速率;V所加酶液或样液体积，单位为毫升（mL）；D酶液或样液的稀释倍数；4.5反应液总体积，单位毫升（mL）。固体样品按式（2）计算：TOC o 1-5 h z325325SOD活力（U/g）=AA325X4.5XXV1 HYPERLINK l bookmark8 50%VmU/mLSOD酶活力单位；AA325邻苯三酚自氧化速率；AA2样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；325D酶液或样液的稀释倍数；V二样液总体积，单位为毫升（mL）；1皿=样品质量，单位为克（g）；4.5一反应液总体积，单位毫升（mL）。3、方法特点本方法以修改Marklund方法和化学发光法测定保健食品中SOD活

50、性。前者SOD活性测定最低检出限为1.17U/mL，相当于1.1x10-8mol/L63。（二）保健食品中过氧化氢酶（CAT）活性的测定g1、分析方法(1)过氧化氢酶的提取称取约1g试样，倒入研钵中。加少量石英砂，粗磨至无整粒样后，量取缓冲液50mL,先加入少量以润湿样品,细磨至糊状后，小心转移至锥形瓶中，用剩余的缓冲液分多次洗净研钵，洗液并入锥形瓶中，剧烈振摇5min,静置2h3h后过滤至比色管中。(2)酶活动度的测定准确移取20.0mL滤液于锥形瓶中，直接煮沸1mino冷却后加入20mL水和3mL2%过氧化氢溶液，摇匀后在30C恒温水浴锅中放置15min,加入5mL10%硫酸溶液，摇匀，用

51、0.2mol/L高锰酸钾标准溶液滴定剩余的过氧化氢，滴定至微红色且30s不褪色为止，记录消耗的高锰酸钾标准溶液体积(V。空白试验：吸取20.0mL滤液于锥形瓶中，直接煮沸1min。冷却后加入20mL水和3mL2%过氧化氢溶液，摇匀后在30C恒温水浴锅中放置15min,加入5mL10%硫酸溶液，摇匀，用0.2mol/L高锰酸钾标准溶液滴定剩余的过氧化氢，滴定至微红色且30s不褪色为止,记录消耗的高锰酸钾标准溶液体积(V。)。过氧化氢酶活动度X按式(3)计算：X=(V-V)xcX17X50X100(3)01mx(100-M)20式中：X过氧化氢酶活动度，单位为毫克过氧化氢每克(mgH2O2/g);

52、V空白试验用去高锰酸钾溶液体积，单位为毫升(mL)；0V试样滴定用去高锰酸钾溶液体积，单位为毫升(mL)；c试剂高锰酸钾标准溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L);m一试样质量，单位为克(g)；M一试样水分含量，；17与1.00mL高锰酸钾标准溶液c(1/5KMnO4)=0.2mol/L相当的H42o2的质量。3、方法特点在pH7.7条件下，从样品中提取过氧化氢酶，在提取液中加入一定量的过氧化氢，是过氧化氢在过氧化氢酶作用下分解，再用高锰酸钾溶液滴定过量的过氧化氢。根据高锰酸钾溶液的消耗量计算出试样中过氧化氢酶活动度。（四）保健食品中前花青素含量的测定651、分析方法固体粉末状试样：根据试样含

53、量称取50mg500mg（精确至0.001g）试样于50mL棕色容量瓶中，加入30mL甲醇，超声处理20min,放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心（3000r/min,10min），上清液备用。含油试样：根据试样含量称取50mg500mg（精确至0.001g）试样于小烧杯中，用5mL二氯甲烷使试样溶解，并倒入50mL容量瓶中，再用甲醇多次洗烧杯，并入50mL容量瓶中，加甲醇至刻度,摇匀。口服液:根据试样含量准确吸取1mL5mL试样，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后，取出15mL置于具塞锥形瓶中，再加入0.5mL硫酸铁铵溶液和2mL试样溶液，混

54、匀，置沸水水浴回流,精确加热40min后，立即置冰水中冷却，过微孔滤膜后高效液相色谱仪测定。高效液相色谱仪：配紫外检测器；超声波清洗器；离心机；液相色谱参考条件：色谱柱：耐低pH型的ODSCg柱,4.5mmx150mm,5pm；柱温：35C;检测器：紫外检测器;检测波长：525nm;流动相：水+甲醇+异丙醇+甲酸=73+13+6+8；进样量：10吐；流速：1.0mL/min,根据保留时间定性，外标法定量。图错误!未定义书签。前花青素的标准色谱图2、方法特点方法的检出限为：1.5x10-4g/100g,方法的定量限为5.0 x10-4g/100go保健食品中番茄红素的测定1、方法提要样品经皂化后

55、用石油醚提取番茄红素，提取液经浓缩后，过中性氧化铝柱净化，洗脱液经氮气吹干后，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。2、试剂和材料(1)含1%BHT的二氯甲烷溶液：称取1.0gBHT(2.8)，用100mL二氯甲烷溶解。(2)提取液:称取10gBHT(2.8)，用1000mL石油醚溶解。(3)定容溶液：量取10mL乙腈，加入90mL含1%BHT的石油醚,摇匀。番茄红素标准储备液：称取番茄红素标准品(2.10)1mg,用二氯甲烷溶解并定容至10mL,番茄红素浓度为100g/mL,置于-18C冰箱避光保存。番茄红素标准工作液:根据需要用含1%BHT的二氯甲烷溶液将标准储备液稀释成10.0ng/m

56、L、50.0ng/mL、100.0ng/mL、1000.0ng/mL、5000.0ng/mL、10000.0ng/mL的标准工作溶液。置于0C4C冰箱中避光保存，可使用3天。层析用氧化铝(中性,74pm150pm)：105C干燥2h,于干燥器中冷至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。(7)氧化铝层析柱:在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉,干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL石油醚预淋洗，洗净柱中杂质后,备用。2、测定方法准确提取0.5g试样(精确至0.01g)，于50mL离心管中，分别加入5mL无水乙醇、50%氢氧化钾溶液3mL，旋涡混

57、匀2min,超声提取10min，置于80C水浴锅中皂化2h,每10min振摇一次，冷却至室温，加入10mL提取液，涡旋提取5min,5000r/min下离心3min,分取上清液于旋蒸瓶中，再用10mL提取液分别提取2次,合并提取液，40C下旋蒸浓缩近干，用10mL石油醚溶解残渣待净化。取10mL待净化液加入至预处理好的氧化铝层析柱中，用10mL石油醚淋洗，并抽空后用10mL含1%BHT的二氯甲烷溶液洗脱，收集洗脱液，于40C下氮气吹干,残渣用1.0mL定容液溶解，过0.22m微孔滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。准确提取0.5g试样(精确至0.01g),于50mL离心管中，分别加入标准工作液

58、1mL,按以上实验步骤进行。液相色相谱条件：色谱柱：WateisXetrraMSC4.6mmx150mm，3.5pm;流动相：50:50(V/V)叔丁基甲醚-乙腈;流速:0.2mL/min;进样量:30yL；柱温:40C。质谱条件:离子源：大气压化学源(APCI)；扫描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测(MRM);气帘气压力(CUR)：30Psi；雾化气压力(GS1):80Psi;离子源温度(TEM):380C;放电针电流(NC)：5.0pA;碰撞气(CAD):9.0Psi;去簇电压(DP)：94.0V;碰撞室入口电压(EP):12.0V;其它参数见表4。表1其他质谱参数化合物监测离子对驻

59、留时间/mmin碰撞气能量(CE)/V碰撞室出口电压(CXP)/V番茄红素537.4/468.34002636537.4/455.5*4002913537.4/413.34003234“*”为定量离子对。在上述色谱条件下，番茄红素的质量色谱峰保留时间约为2.53min,标准溶液的多反应检测图见图13。2、测定低限本方法番茄红素的测定低限为0.100mg/kg。XCof+NRM（3pairs）:537.400/468.O）r0mSa叩le13（1ppmf20100803ffWieatedbbulizer）2.5e42.4e42.3e42.2e42.1e42.0e41.9e41.8e41.7e41

60、.6e4s1.5e4C1.4e41.3e41.2e41.1e41.0e49000.08000.07000.06000.Q5000.04000.03000.02000.01000.00.0Max.4827.5cps.Tine,mn图错误不能识别的开关参数。番茄红素标准溶液的多反应监测图（六）高效液相色谱法测定保健食品中的番茄红素661、方法步骤称取均匀试样2g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加10mL的丙酮/石油醚（体积比为1:2）,加入10mL水（固体样品）,旋涡1min,超声振荡10min,5000r/min离心10min,残渣再用10mL的丙酮/石油醚（体积比为1:2）提取1次，离