发酵基因工程菌

1、第八章 基因工程菌培养一、概述基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白质和非蛋白质。基因操作：敲除或插入基因片段、增强 启动子代谢工程基因插入载体，转化工程菌1细胞因子、疫苗、酶2二、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统 要求：翻译后的修饰要简单 如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中常用的宿主系统有：大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞31、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠杆菌作为宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠

2、杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。4大肠杆菌作为宿主的主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。包含体蛋白是不折叠的，必须重新溶解并使它复性。大量的外源蛋白会触发热冲击响应。增加蛋白水解酶的活性。此时，蛋白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质N端常多一个甲硫氨酸残基，引起免疫反应。5真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原。 不做人体

3、注射用药。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。（3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。62、G+细菌 枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分泌（excretion）到胞外。不能使蛋白质糖基化缺陷:枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差其他: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。73、低等真核细胞酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等优点 生长快 最大生

4、长速率是大肠杆菌的25%个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。不产内毒素有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。8影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状

5、真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。 94、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转译后处理（修饰）与在整个动物中相同，在某种情况下可能转译后修饰有些不同，但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。10 三类主要基因工程表达体系的比较表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 部分可高产 对原核好 不大 融合蛋白 酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白

6、 胞外 天然动物细胞 完整 胞外 几乎可为 可能有 糖基化蛋白 可高产 天然产物 致癌因素11三、利用基因工程菌生产的特点（一）基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。（二）基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。12（三）基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得

7、快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失结构不稳定性宿主细胞调节突变 131、分离丢失 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。为什么会出现质粒丢失呢？质粒可分为高拷贝质粒（20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。14在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如100

8、0L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。15分离丢失示意图162、质粒结构不稳定性 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这种培养情况就是结构不稳定性。173、宿主细胞突变

9、宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。184、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么变异了的系统将最终占优势，基因不稳定性就

10、出现。 （四）表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。19提高质粒稳定性的方法 1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢 失菌的生长。 2、通过控制环境参数（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度），调节比 生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢，因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率，可以改善质粒的稳定性。20四、重组大肠杆菌的培养策略关键点：高密度、高表达菌密度的测定：

11、光密度（OD值或A值）在波长600660nm菌生长的障碍是重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。21高表达的障碍是：外源基因的不稳定，造成表达的下降高生长速率与高表达之间的矛盾乙酸的产生蛋白的降解22 高密度培养的措施分批补料培养 以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌

12、的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批流加补料培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制 23控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加241、控制基质浓度流加用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。252、恒pH流加大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是由于菌体分解LB培

13、养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了比生长速率降低的时间，细胞密度是无流加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。263、恒溶氧流加用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。Konstantinov等进一

14、步发展了这种方法，用DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度和高表达274、控制比生长速率的葡萄糖流加菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生长速率。28五、生长与表达的影响因素 不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%2 2 250 2.6 7.8 0.77 4

15、2.08 16.7%3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%*鲤鱼生长激素基因工程菌291、溶氧浓度对工程菌发酵的影响在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现，当发酵液的溶氧为1.82.6ppm/L时，菌体湿重为1.92.08g/L外源基因表达量为13.8%16.7%，而当溶氧值提高到4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用

16、。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。302、pH值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白的表达不利，因此，表达时要调节pH在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。313、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。诱导

17、时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64%*L-天冬酰氨酶324、诱导时机对表达的影响诱导时机指加入诱导剂的时间以天冬酰氨酶表达为例，见表。在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。33 诱导时机对酶表达水平和活力的影响生物量（A600） 酶活力 酶表达水平 0.

18、015 6.0 15.0% 0.049 19.1 31.1% 0.160 72.5 41.5% 0.225 102.6 49.8% 0.295 165.0 57.7% 0.360 105.5 53.4% 0.410 62.4 44.5% 0.450 30.2 22.5%*L-天冬酰氨酶0.0340.1110.0650.070.0650.050.04345、乙酸对生长和表达的影响（1）乙酸的产生及抑制作用机理 当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。 为什么会产生乙酸？Han认为细菌在低比生长速率下

19、通过氧化代谢（三羧酸循环）的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径提供ATP和NADH。35乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应。EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境中以离子化（CH3COO）和质子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H，这样就降低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减

20、弱了质子的推动力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。36（2）减少乙酸积累的对策宿主菌不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使乙酸合成受阻。37培养基培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。 Klemam等研究了培养基pH值对产生乙酸的影响，发现重组大肠杆菌W3200在葡萄糖浓度为5g/L、pH6.0

21、的培养基中乙酸生成量为6g/L.而pH7.5为12g/L。38降低比生长速率细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续培养中，当稀释速率超过0.2h1才能检测到乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。降低培养温度将温度从370C降低到26-300C可以降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。39透析培养在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组菌的高密度发酵。Lee等用中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可

22、以在较高的葡萄糖浓度下培养重组菌而得到较高的密度40限制性流加葡萄糖利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。如pH，OUR，CER作为控制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。41六、甲醇营养型酵母的生长和表达 （一）酵母作为宿主菌的优点单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于基因工程操作具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。42 酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主菌之一，由于人们对酿酒酵母的遗传学和生理学背景了解得

23、多，及其表达的安全性。但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱导；分泌效率低，特别是对分子量大于30KD的外源蛋白几乎不分泌；表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；不适于高密度培养。43（二）甲醇营养型酵母甲醇营养型酵母主要包括Candida、Torulopsis、 Hansenula、Pichia。用作表达宿主株的主要是Hansenula和Pichia。基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型酵母作为第二代酵母表达系统。44甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源。因

24、为甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶（Alcohol Oxidase,AOX）二羟丙酮合成酶（Dihydroxy-acetone synthase,DHAS）和过氧化氢酶（Catalase），表达的DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的60-80%。而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎不表达。45进一步研究表明，AOX的表达是转录水平调控的，其启动子能非常有效地控制外源基因的表达。已经在P.pastoris染色体中鉴定了二个AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1编码的蛋白质与AOX2编码的蛋白质有97%的同源性，但AOX1基因的启动子（PAOX1）受甲醇强烈诱导，而PAO

25、X2则很弱。H.polymorpha染色体只有一个AOX基因，也受甲醇调节。46甲醇营养性酵母的另一个特点是甲醇代谢所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体中，形成区域化。在葡萄糖为碳源时，菌体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80%，里面的蛋白质主要AOX和DHAS。47自1987年Gregg等首次在P.pastoris菌中表达乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，至少有40多种外源蛋白在P.pastoris 和H.polymorpha中获得表达。表达产物分泌到培养液中或聚集在胞浆，表达量最高的可达全菌蛋白的32%或每升12g产物。H.polym

26、orpha表达比P.pastoris有更多的优点，如更高的耐热性（理想温度为37-430C，而P.pastoris为300C）和在甲醇诱导下更快的生长速率，可减少培养时间，降低污染机会。 H.polymorpha更适于大分子量蛋白（150KD）的表达与分泌。48为了提高外源蛋白在酵母细胞中的稳定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下几种方法：在培养液中补加一些富含氨基酸的组分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，给酵母细胞蛋白酶提供过量的底物，以减少目的蛋白的水解；由于P.pastoris能耐受较宽的pH范围（pH3.0-7.0），因此可调培养液pH 值抑制蛋白水解酶活性；改造P.pastoris表达宿

27、主菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白稳定。49酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，如过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重要，过氧化物酶体内不含DNA，也无蛋白质合成机制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基因编码表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋白质结构中必定存在一些进入过氧化物酶体所必须的局部信息。如果把外源蛋白运输进入过氧化物酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白水解酶降解，增加其稳定性，还可减少外源蛋白对宿主的毒害作用。目前已鉴定出二种甲醇营养型酵母分拣外源蛋白进入过氧化物酶体所需的靶信号PTS1和PTS2。50由于甲醇营养型酵母表达系统具有以下的优点（1）应用AOX启动子

28、，转录效率高，易于诱发调控；（2）表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，适于高密度发酵，产量高；（3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等.因此最近十几年来，人们越来越多的应用它作为外源基因表达的系统。51（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素1、甲醇浓度的影响例：基因工程菌P.Pestoris表达（人骨唾液酸）rHSA按摇瓶培养方法每24h分别补加甲醇使其在培养基中浓度为5、10、20、30、40、50gL诱导培养96h，结果见表2(表中数据为2个发酵瓶平均值)。52 在甲醇浓度为10gL时毕赤酵母表达目的蛋白量达到最高，这可能是当甲醇浓度小于10gL，甲醇成为限制性底物，限制了蛋白的表达当浓度高于2

29、0gL时，甲酵浓度过高，对菌的生长和目的蛋白的表达有抑制作用。因此，在摇瓶条件下，甲醇的最佳诱导浓度为10gL。532、pH对基因工程菌P.Pastoris表达rHSA的影响按摇瓶培养方法，把菌种接至用0.2mol/L的磷酸缓冲液配制好的摇瓶培养基中，pH分别为5.43、5.72、5.84、5.98、6.29、6.59和7.05，每24h加甲醇至终浓度10gL进行诱导培养。5455由基因工程菌P.Pastoris表达目的蛋白和细胞光密度曲线(图1)可以看出pH为5.84时目的蛋白表达量最高。pH为5.43时，目的蛋白基本没有表达，但细胞光密度极大，说明在低pH值条件下，适合细胞生长而不适合目的的蛋白表达；当pH值在5.727.00时，细胞光密度基本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降的趋势，pH为7.05时，目的蛋白表达量明显下降。因此，既利于P.P