常见的IP丨Co-IP问题-get

1、这些常见的IP/Co-IP问题，get！先一起和Abbkine了解一下 HYPERLINK /ip-co-ip-5/ IP/Co-IP的结果解读：下图为验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用的结果图。由图可以发现，该实验被分为两组：input组及IP组。第一块胶图是IB验证蛋白X的存在，第二块是IB验证蛋白Y的存在。由对照组的条带可以得到结论：蛋白X与蛋白Y都是存在的。IP组的第一个条带表示利用IgG进行沉淀实验，结果蛋白X与蛋白Y没有被沉淀下来，说明蛋白X、蛋白Y不能与IgG结合（阴性对照，用于排除蛋白与抗体非特异性结合的可能性）；IP组的第二条带表示利用蛋白X进行沉淀实验，结果蛋白X被沉淀下

2、来，蛋白Y也被沉淀下来，由此得到结论：蛋白X-蛋白Y之间存在相互作用。在CO-IP-WB鉴定结果中，IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带，说明IP过程成功；银染胶图中，IP组相对于IgG组有更多蛋白条带、且存在差异，说明CO-IP过程捕获到互作蛋白。然后一起看看，关于IP/Co-IP常见问题和解决办法：Q：IP/Co-ip实验中IgG阴性对照的意义是什么？A：排除污染的可能性，例如检测一个兔子细胞的某种蛋白质，若没有设置IgG的对照，而操作中有非特异性蛋白质，又和设计的抗体有作用，就会出现阳性的结果。如果做了lgG阴性对照，对照没有出现阳性就说明没有非特异性的蛋白，对照出现阳性，说明抗

3、体有非特异结合到杂蛋白的可能，需要重新开始实验。Q：如何避免轻重链的干扰？A：1、IP一抗与WB一抗来源一致或者两种抗体来源不一致时，二抗有交叉反应，使用IPkine二抗可以避免轻重链的干扰。2、靶蛋白丰度较低，仪器延长曝光时间，导致IgG阴性对照出现杂带：增加Input和IP泳道上样量，减少曝光时间，防止轻重链（杂带）的干扰；3、阴性对照IgG和IP一抗加入偏多：对照IgG抗体量较多，易导致杂带形成，阴性对照IgG使用量建议调整到1ug以下。Q：通过WB验证发现，没有想要的目的条带A：没有目的条带可以是诸多原因导致的。1、有可能是样品被蛋白酶降解，对应的策略是需要添加蛋白酶抑制剂，且所有操作

4、保持4以下冰上操作并防止冻融。2、有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，则需要调整IP或IB抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。3、抗体亲合力太低，选用适合于IP或IB的相应抗体；4、有可能IP抗体未与琼脂糖/磁珠结合。此种情况则需要选选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥。5、若Tag未暴露在融合蛋白构象的表面，则需要改变tag融合表达部位。6、裂解液盐碱度太高，则需要改用低盐碱度裂解液。7、目的蛋白在样本中表达量低或者不表达，则需首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理。8、目的蛋白未被洗脱可能导致没有条带，须保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的

5、强度和pH值合适。9、抗体选择不当或者不工作，则须利用WB对抗体进行验证。Q：通过WB验证发现，虽然可见目的条带，但是背景很高A：背景高可能由多方面原因造成：1、由非特异蛋白结合导致背景高。若要避免非特异性蛋白结合，则需要在无血清溶液中裂解细胞，且在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗免疫沉淀后增加漂洗次数和盐碱度（高盐或去垢剂）。2、实验仪器或液体被污染。使用洁净的仪器或液体。3、转移膜上的非特异吸附导致背景高。实验操作过程中戴手套，使用镊子夹取，不要接触膜转移面。4、制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体，则在制备样品后进行短暂超声处理（3次，每次5秒钟），然后离心纯化，取上

6、清后进行后续试验。5、洗涤不彻底，则需要多次洗涤，并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度。6、可能有非特异性蛋白吸附于珠子上，则须进行Preclearing以排除非特异性吸附。7、抗体本身特异性不好可能导致背景高，则须选择合适的抗体，可以考虑单抗。8、使用了过多的细胞或组织进行裂解导致背景高，则须减少样本量，推荐100-500g细胞裂解物。9、蛋白降解也可能出现高背景的情况，次情况下须保证样品中加入了蛋白酶/磷酸酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。Q：互作蛋白信号弱A：互作蛋白信号弱可能是由于裂解液中的去垢剂浓度太高或配方过于剧烈、蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定等原因导致。相应的举措有：1、降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类；2、受