免疫荧光原位杂交的原理应用

1、荧光原位杂交技术编辑荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是根据 已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核 苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存 在与丰度。1特点编辑原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记 的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较 灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操 作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。荧

2、光原位杂交技术FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体 DNA的结构。缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。2简介编辑1969年，Gall和Pardue等首次将同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987 年，染色体原位

3、抑制杂交法的创建，使FISH技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物 素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990年， Nederlof等用3种荧光素成功探测出了 3种以上的靶位DNA序列，从而宣告了多色FISH 技术的问世。FISH技术是一种非放射性分子遗传学实验技术，其基本原理是将直接与荧光素结合的 寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色 体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性一退火一复性一洗涤后即 可形成靶DNA与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微 镜下显影，即

4、可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。FISH技术有以下几点优势：安全、快速、灵敏度高；探针能较长时间保存；多 色标记，简单直观；可用于中期染色体及间期细胞的分析；可应用于新鲜、冷冻或石 蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。3原理编辑基本原理荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH 所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现， 使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位 等。原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均需重新标记探针， 已标

5、记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察 结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面， 可能引起计数上的误差等。与之比FISH则具有操作操作简便，探针标记后稳定，一次标记 后可使用二年.方法敏感，能迅速得到结果.在同一标本上，可同时检测几种不同探针.不 仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于间期细胞的染色体数量及 基因改变的研究。荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染 色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性， 即可

6、形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物 素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检 测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。技术要点FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞.间期细胞可以是冰冻切片， 也可以是细胞滴片或印片。生物素(Biotin)，地高辛(digoxigenin)，dinitrophenyl(DNP)， aminoacetyl fluorine(AAF)等均可用于探针标记。前两者较为常用，通常采用切口平移法(Nick translation)或随机引物法(Random Pr

7、imer)对探针标记。在已知探针DNA结构及序列情况下 也可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用于Biotin标记的探针应大于1000bp以下 的探针，不易标记成功。对PCR技术来标记。近年来，Vysis公司成功的生产些大片段的 DNA探针(100-400kb)。由于控针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂 交过程进一步简化，而且杂交信号更强。如探针是具有重复序列的DNA或粘粒、YAC探针， 在杂交液中加上用超声断碎的人体胎盘组织DNA或Cot DNA，以阴断探针和染色质之间非 特异性的结合。荧光信号在高压汞灯产生的短波激发光下常引起荧光信号淬灭的发生，可将DAPI或PI稀 释

8、于P-phenlenediomine的甘油缓冲液中。任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号，但对单 拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察FITC、 Texas-Red等多种颜色的FISH信号，不论是染色体还是单拷贝基因的FISH信号均可用高度 敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过CCD(charge coupled device)的照相系统或Laser Scanning Confocal Imaging System (激光扫描共焦成像系统)将摄取的信号储存在计算机内， 经软件处理后，将信事情显示在荧光屏上。由于有多种方法标记DNA探针，故一次杂交可 以

9、同时 观察多个探针的信号，如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记，杂交后 用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分别与探针上的Biotin和Digoxigenin结合，应用双色滤 光片，在显微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的FITC和红色荧光的Texas-Red信号。同 理，采用三种或三种以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等标记探针，然后用多种不 同颜色的荧光素，如FITC (绿色)，Rhodamine(红色)，AMA或Cascade Blue(兰色)等结合 抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号，如采用不同的排列组合，最多可同时

10、 检测7种不同的探针。由于常规的荧光显微镜的照像系统，彩色胶片不易多次曝光，限制了 这种联合标探针的应用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系统，先分别多次 摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统事例各次得到的影 像，最终形成一个复合的多颜色的图像。此外，对已做过G显带的染色体片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH这样可更清晰 的辩认各条染体及染色色体结构异常(包括某些复杂的易位，插入，倒位等)FISH和G显 带技术结合不仅可以用新近G带处理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH 技术可成功的帮助细胞遗传学家做

11、出回顾性分析。FISH技术和RFLP (Restrict Fragment Lenth Polymorphysim)结合，可以更精确地描述原必 于染色体长短臂等结构改变和染色体梳型或复制片段的性质。FISH和细胞免疫化这技术结 合，可以同时用多种颜色反应检测不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找 到基因的位点，转录和翻译和产物，有助于对核甙酸结构与功能以及基因表达产物之间关系 的研究。在基因图谱绘制中，FISH和Linkage mapping结合起来，即使对具有高度多形态的 基因位点也能较精确地定下来。4应用编辑该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗

12、 传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。FISH的临床应用在细胞遗传学检查中，重复序列的探针应用最多，它们是a卫星DNA、B-卫星DNA和经 典卫星DNA探针。a卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒。B卫星DNA位于顶端着 丝粒染色体及号染色体的异染色体质周围.经典卫星DNA（classic-saiellite DNA）有着AATGG 短片段重复，位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围。后两种探针除去可 用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改变的检查。三种探针产生的荧光信号都在 染色体着丝粒或附，因此常用于鉴定，羊水细胞可不培养直

13、接作FISH检查，发现在21三 体Down氏综 合片）18三体（Edward综合征），13体（Patau综合征），45、XO（turner 氏综合征）和47XXY （Klinfelter综合征）。FISH在白血病方面和应用较为方泛的是慢性粒细胞白血病bcr/abl易位DNA探针，采用 Digoxigenin标记于22号染色体上的bcr基因，用Biotin标记位于9号染色体上的Abl基因， 然后用红绿二种不同颜色的荧光素检测，慢料常有染色体易位t（9;22）（q34;q11）而引起bcr和 Abl基因的融合，这时不需要检测分裂中期细胞，在间期细胞中就可以见到二种颜色讯号的 混合，从而可以确定是P

14、h阳性细胞。这特别适合化疗后缓解的CML，极易发现残存的白血 病细胞。其它如t （15； 17）易位DNA探针，t （18； 21）易位DNA探针分别可用于急性 早幼粒白血病（APL）和急性粒细胞白血病（AML）的诊断。此外在白血病的诊断方面， 还有等位17号染色体长臂iso（17q）,16号染色体长臂间倒位inv（16）探针等，都有商业出售。 在实体肿瘤方面，应用较为广泛的是HER-2/neu基因探针。乳腺癌细胞中Her/2-neu基因的 扩增常预示着患者预后较差。在FISH技术之前的所有测定基因扩增的方法，都是采用经典 的分子生物学方法South blotting等），但这些方法与FISH

15、相比，不仅费时费力，而且也不 可能在细胞水平上观察到基因扩增的状态。FISH技术的更大优点是可以在间期细胞核上观 察到DNA扩增的直接证据，而且间期细胞核所显示出的护增DNA荧光信号其数量多少及 荧光强度常与DNA扩增的水平有关。1998年美国政府FDA批准了作为基因治疗的一种单 克隆抗体Herceptin），可配合化疗来治疗部分晚期转移性乳腺癌病人，约25-30%的乳腺癌病 人有HER-2/neu基因的扩增和/或过度表达。这部分病人适合Herceptin治疗、FDA在此前一 些时候批准了 Vysis公司的HER-2/neu基因DNA探针在乳腺癌临床诊断上的应用。HER-2/neu基因的扩增或

16、过表达也见于卵巢癌、子宫内膜癌、涎腺肿瘤及胃癌等恶性肿瘤。 可以预，在不久的将来Herceptin和HER-2/neu基因DNA探针可用于这些肿瘤的治疗和诊 断。其它一些实体瘤的肿瘤的肿瘤基因的探针如N-myc,C-myc,CyclinD1等虽有商业出售， 但目前还未用于临床。FISH在细胞遗传学研究的应用染色体x,y,21,18和13的数量变化常与先天性疾病有关。采用染色体着丝粒重复序列DNA 作为探针，可以确定分裂细胞或间期细胞这些染色体的数目止，如采用21号染色体的涂抹 （painting）探针，根据标记区域的大小可检测出Down氏综合征的发生。实体肿瘤的染色体研究比较困难，这是由于获取

17、足够量的分裂期肿瘤细胞比较困难。使用染 色体着丝特异探针，对间期细胞进行染色体数量变异分析，可获得较好的结果。因此FISH 技术十分有助于肿瘤细胞遗传细胞遗传学的研究。Hopman采用FISH技术研究膀胱癌，发 现9号染色体的丢失。FISH检测的结果与流式细胞仪分析的结果完全一致。Waldman等发 现染色体数目的改变和肿瘤的分化及分期有着密切关系，如7号染色体啬常见于有较高的 Brdard分级和有较高的PCNA标记指数的晚期、恶性度高的肿瘤,Waldman认为这一现象可 涉及到7号染色体上某些特殊基因的表达增加或被抑制。采用多种染色体探针，以不同的颜 色标记，更适合于实体肿瘤染色体数目改变的

18、异质性研究。对于G或Q显带难以确定的染色体结构改变，运用FISH技术可以帮助解决。许多不能归 类的标记染色体，FISH技术可以确定畸变的来源，如Miura等报告21例非小细胞肺癌（NSCLC）的染色体改变，其中一例有2个标记染色体，用FISH检测后证实是来自9号染 色体的短臂梁色体上微细带的丢失，普通显带常不易发现，用特定的基因探针检测时，在正 常应该有荧光信号的部位如不出现信号，表示有染色体的丢失。Lux等用Ankyrin基因作探 针，检测遗传性球殂红细胞增多症病人的染色体和间期细胞，发现有这个基因的缺失。Taguchi等采用靠近3p21带附近的6个不同位点的探会，比较异常和正常3号染色体，

19、确定 胸膜间皮瘤有3p21带的缺失并推测这个区域可能存在重要的抑癌基因，为了进一步的分子 生物学研究提供了重要线索。选择按一定顺序排列的基因探针，可以帮助确定染色体倒位， 尤其是臂间倒位的性质，如急性白血病有16号染色体的倒位，选择两个分别位于断裂点近 端和远端的粘粒探针，同时用16号染色体着丝位探针，正常细胞荧光信号的次序是：粘粒 粘粒-着丝粒，而白血病细胞的信号的次改变为粘粒-着丝粒-粘粒。杂交细胞通常是含有单个人类染色体啮齿动物细胞。这种杂交细胞常用于绘制基因图谱或生 产单个染色体特DNA库。杂交细胞在培养过程中，人体染色体极易丢失或发生染色体重排， 因此，需要对杂交细胞定期进行细胞遗传

20、学检查，采用人体组DNA作为探针或相应人体染 色体涂抹探针，可以很主便的检测这些改变。FISH在基因图谱绘制的应用采用FISH技术，不仅可以直接确定某一 DNA链在染色体上的位置，而且诮用多种颜色荧 光素的标记控针，还提供了一个简单的确定基因顺序的方法。可用不同颜色荧光素标记两个 不同的DNA链，而且他们在染色体上的距离大于1Mbp时，可以依据不同探针信号的排列 关系分辨他们在染色体上的顺序。采用5-Burd处理的细胞，可以获得高分辨显带的染色体， 从而增加DNA链标记到染色体上的分辨能力。如果使用间期细胞，两个DNA链的距离可 以缩短至50Kbp，这个间距是染色体上的分辨距离的二十分之一。不同探针的次序可以通过 测量其间期细胞的距离来确定。确定DNA链在染色体上精细位置，适用于检查某些特殊的染色体易位和缺失，如