真核基因转录调控教程

1、真核基因转录调控教程第七章 真核生物基因的表达及其调控第一节 真核生物表达调控特点真核生物基因的表达调控系统远比原核生物复杂真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所决定基因表达调控上的巨大差别。原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。 真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组就包含有3109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA的1000倍，是噬菌体总D

2、NA的10万倍左右！真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。 第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。 原核生物真核生物操纵元调控。多样化调控，更为复杂。 基因组小，大肠杆菌：总长4.6106bp, 编码4288个基

3、因, 每个基因约1100bp。 基因组大，人类基因组全长3109 bp，编码10万个基因，其余为重复序列。基因分布在同一染色体上，操纵元控制。 DNA与组蛋白结合成染色质，染色质的变化调控基因表达；基因分布在不同的染色体上，存在不同染色体间基因的调控问题。 适应外界环境，操纵元调控表达。 基因差别表达是细胞分化和功能的核心。转录和翻译同时进行，大部分为转录水平调控。 转录和翻译在时间和空间上均不同，从DNA到蛋白质的各层次上都有调控，但多数为转录水平调控真核生物与原核生物的调控差异一、真核基因表达调控的特点 与原核生物比较它具有一些明显的特点： (一)真核基因表达调控的环节更多 基因表达是基因

4、经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。 (二)真核基因的转录与染色质的结构变化相关 。真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中DNA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象： 1.染色质结构影响基因转录染色体结构复杂 由DNA、组蛋白、非组蛋白等大分子组成; DNA顺序重复;基因不连续性,真核生物基因的不连续性和转录后加工是

5、真核基因有别于原核基因的又一重要特征。2、存在许多基因家族(gene family)来源相同、结构相似、功能相关的基因组成单一的基因簇或称基因家族。同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇；更多的时候，它们却分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同的染色体上，具有各自不同的表达调控模式。3、组蛋白的作用：组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去

6、阻遏促转录作用。 4.转录活跃的区域也常缺乏核小体的结构。这些都表明核小体结构影响基因转录。5.转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加。活跃进行转录的染色质区域受DNase 消化常出现100200bp的DNA片段，且长短不均一，说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNase 高敏感点(hypersensitive site)。这种高敏感点常出现在转录基因的5侧区、3末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近，分析该区域核小体的结构发生变化，可能有利于调控蛋白 结合而促进转录。 6. DNA碱基修饰变化：真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,

7、m5C)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5侧区的CG序列中实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，可见DNA的甲基化对基因表达调控是重要的。 由此可见，染色质中的基因转录前先要有一个被激活的过程，但目前对激活机制还缺乏认识。(三)真核基因表达以正性调控为主： 真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普

8、遍；真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。因此，真核基因表达以正性调控为主导。 三、真核基因转录水平的调控 真核细胞的三种RNA聚合酶(、和)中，只有RNA聚合酶能转录生成mRNA，以下主要讨论RNA聚合酶的转录调控。(一)顺式作用元件(cis acting elements) 真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)；近

9、年又发现起负性调控作用的元件静止子(silencer) 1.启动子 与原核启动子的含义相同，是指RNA聚合酶结合并启动转录的DNA序列。 但真核启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用，不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同启动子序列也很不相同，要比原核更复杂、序列也更长。 真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长730bp。最常见的哺乳类RNA聚合酶启动子中的元件序列见下表

10、。 元件名称共同序列结合的蛋白因子 名称分子量结合DNA长度TATAboxTATAAAATBP30,00010bpGC boxGGGCGGSP-1105,00020bpCAAT boxGGCCAATCTCTF/NF160,00022bpOctamerATTTGCATOct-176,00010bpOct-253,00020bpkBGGGACTTTCCNFkB44,00010bpATFGTGACGTAFT?20bp哺乳类RNA聚合酶启动子中的元件序列启动子中的元件可以分为两种：核心启动子元件(core promoter element) 指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始

11、点及其上游25/30bp处的TATA盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。上游启动子元件(upstream promoter element) 包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。 不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的调控。2.增强子 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占1002

12、00bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点： 增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离14kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。 增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。 增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。例如当含有增强子的病毒基因组整合入宿主细胞基因

13、组时，能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；当增强子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的新位置周围基因的转录。使某些癌基因转录表达增强，可能是肿瘤发生的因素之一。 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。 增强子可能有如下3种作用机制：影响模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录；将模板固定在细胞核内

14、特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动；增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶II进入染色质结构的“入口”。3.静止子 最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看到：静止子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。 第二节 真核生物DNA水平上的基因表达调控一、真核生物DNA水平上的基因表达调控特点 分子生物学的最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成

15、RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物体的发育。 高度重复基因的形成通常与个体分化阶段DNA的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化。 这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括了基因丢失、扩增、重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的，因为它使基因组发生了改变。二、“开放”型活性染色质（active chromatin）结构对转录的影响真核基因的活跃转录是在

16、常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋松弛，形成自由DNA。这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化等，这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，诱发基因转录。用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活跃状态的基因比非活跃状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。 鸡成红细胞（erythroblast）染色质中，-血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。 鸡输卵管细胞的染色质中被DNA酶I优先降解的是卵清蛋白基因，而不是-血红蛋白基因。存在于“灯刷型”染色体（l brush）上的环形结构可能与基因的活性转录有关。

17、“灯刷型”染色体只有在两栖类动物卵细胞发生减数分裂时才能被观察到，它是染色体充分伸展时的一种形态。高倍电镜下观察发现，灯刷型染色体上存在许多突起的“泡”状或“环”状结构，有时还能看到RNP沿着这些突起结构移动，表明这些DNA正在被RNA聚合酶所转录。三、基因扩增基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。 两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增非洲爪蟾的染色体上有约450拷贝编码18Sr RNA和28S rRNA的DNA，在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了1000倍。一旦卵母细胞成熟，多余的rDNA就没有用了，

18、将被逐渐降解。受精之后，染色体DNA开始复制，并通过有丝分裂的方式，不断扩大细胞群体。在此期间，多余的rDNA继续被降解，直到分裂产生几百个细胞时，rDNA的过剩现象就不复存在了。四、基因重排 将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。 真核生物最典型的例子是免疫球蛋白在成熟过程中的重排以及酵母的交配型转变。 V、C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞发育分化时，通过染色体内DNA重组把4个相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生了具有表达活性的免疫球蛋白基因。五、DNA甲基化与基因活性的调控1、DNA的甲基化DNA甲基化是最早发现

19、的修饰途径之一，这一修饰途径可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。 大量研究表明，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。 DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中。 实验证明，这个过程不但与DNA复制起始及错误修正时的定位有关，还通过改变基因的表达参与细胞的生长、发育过程及X染色体失活等的调控。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-

20、甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。 在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C 通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧啶。 由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，这段序列往往被称为CpG岛。2、真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型甲基转移酶，另一种是从头合成型甲基转移酶日常型主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。该酶催化特异性极强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，从而保证

21、DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变。从头合成型甲基转移酶催化未甲基化的CpG成为mCpG，它不需要母链指导，但速度很慢。3、DNA甲基化抑制基因转录的机理DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。 研究表明，当组蛋白H1与含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时，DNA的构型存在着很大的差别，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。有实验用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作

22、为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。 5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的，基因的5 端和3 端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。 对于弱启动子来说，稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。当这一类启动子被增强时（带有增强子），即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。 因为甲基化对转录的抑制强度与MeCPl（methyl CpG-binding protein l）结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡

23、决定了该启动子是否具有转录活性。4、DNA甲基化与X染色体失活X染色体失活是发育过程中独特的调节机制。雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，这个信息便能够稳定地传递给子代细胞，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。第三节 反式作用因子(trans acting factors)一、反式作用因子(trans acting factors)由不同染色体上基因座位编码的、能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件812bp核心序列上并参与调控靶基因转录效率的这些结合蛋白，称作反式作用

24、因子(transacting factor)。它们在转录调节中具有特殊的重要性。这类DNA结合蛋白有多种，能特异性识别这类蛋白的序列也有多种正是不同的DNA结合蛋白与不同识别序列之间在空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用，构成了复杂的基因转录调控机制的基础。 真核生物启动子和增强子是由若干DNA序列元件组成的，由于它们常与特定的功能基因连锁在一起，因此被称为顺式作用元件。这些序列组成基因转录的调控区，影响基因的表达。反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 如果某个蛋白是体外转录系统中起始RNA合成所必需的，它就是转

25、录复合物的一部分。根据各个蛋白成分在转录中的作用，将整个复合物分为3部分： 参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。与转录的起始或终止有关的辅助因子，不具有基因特异性。与特异调控序列结合的转录因子。它们中有些被认为是转录复合物的一部分，因为所有或大部分基因的启动区都含有这一特异序列。更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白，它们是起始某个（类）基因转录所必需的。二、反式作用因子可以分为3类 (1)通用反式作用因子，主要识别启动子的核心启动成分 （2）特殊组织与细胞中的反式作用因子 （3）和反应性元件（response elenents）相结合的反式作用因子。 如HSE（热休

26、克反应元件，heat shock response element）， GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）；MRE（金属反应元件，metal response element）；TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response element);三、DNA结合蛋白的共同特性： （1）具有一些与DNA结合的螺旋区（2）能形成二聚体（3）有一个共同的基本序列基本序列由4050个氨基酸组成，含有2个两亲的(既有极性基也有非极性基)螺旋，由2个长度不等的连接区(环)相连。通过两条螺旋对应位置上的疏水性氨基酸残基之间的

27、相互作用，可以生成同源二聚体或异源二聚体。每个螺旋区长15一16个氨基酸，其中有几个氨基酸残基是保守的。两个螺旋区之间的环使两个螺旋区可以彼此独立地相互作用。第四节 真核基因转录调控的主要模式一、蛋白质磷酸化、信号转导及基因表达蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程， 其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。 蛋白质的磷酸化反应是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。 已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生

28、物体内普遍存在的信息传导调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、神经递质的合成与释放甚至癌变等等。蛋白激酶的种类根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类： 1、丝氨酸/苏氨酸型。这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化。2、酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸残基。3、是“双重底物特异性蛋白激酶（dual-specificity protein kinase），既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化。 细胞受刺激以后，通过蛋白质磷酸化及一系列级联放大过程将胞外信号转化为细胞内信号，从而引起广泛的生理反应。二、激素的调控作用：

29、 激素诱导模式：真核生物内的调控信号来自体内激素，这些可扩散的物质称反式作用因子。 许多类固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮质激素和雄激素）以及一般代谢性激素（如胰岛素）的调控作用都是通过启始基因转录而实现的。 三、作用机制： 靶细胞具有专一的细胞质受体，可与激素形成复合物，导致三维结构甚至化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内，并与染色质的特定区域相结合，导致基因转录的起始或关闭。 研究发现，体内存在的许多糖皮质类激素应答基因都有一段大约20bp的顺式作用元件（激素应答元件），该序列具有类似增强子的作用，其活性受激素制约。 靶细胞中含有大量激素受体蛋白，而非靶细胞

30、中没有或很少有这类受体，这是激素调节转录组织特异性的根本原因。所有固醇类激素的受体蛋白分子都有相同的结构框架，包括保守性极高的、位于分子中央的DNA结合区，位于C端的有较强同源性的激素结合区和保守性较小的N端。该区的具体功能不详，但它的存在保证了转录的高效进行。研究还发现，如果糖皮质激素受体蛋白激素结合区的某个部分丢失，就变成一种永久型的活性分子，即无需激素诱导也有激活基因转录的作用。第五节 基因转录后水平的调控一、不同剪接方式可产生不同的mRNA： 组成型剪接、交替剪接、 组成型剪接：大多数前体mRNA都含有多个内含子，他们常被有序的逐一切除，形成一个由各外显子连接而成的成熟mRNA，这种剪

31、接方式称。交替剪接（alternative splicing)：来自同一个基因的前体mRNA中某个内含子5端供点又可在特定条件下与另一个内含子的3端受点进行剪接，从而删除这两个内含子及其中间的全部外显子和内含子。这样，一个前体mRNA就可因剪接方式不同产生多种mRNA，转译出多个不同蛋白质.剪接方式有3类 类型1：不同5末端 交替剪接 类型2：不同3末端 类型3：不同剪接方式二、RNA编辑： 定义：转录后的RNA在编码区发生碱基插入， 缺失或转换的现象。 意义：纠正某些移码突变；构建或删除起始密码子、终止密码子；增减核苷酸扩充遗传信息。三、基因翻译水平的调控1. 翻译多肽过程的调控： 真核生物的许多组织或细胞中，经转录mRNA受抑制不能翻译成多肽，以失活的状态贮存。如植物种子在发芽的早期阶段，虽没有mRNA 的合成，但