微生物检验教学课件（扬州大学）第九节 肉毒梭菌检验

1、第九节 肉毒梭菌检验Clostridium botulinum肉毒梭菌在严格厌氧的条件下可产生极其强烈的外毒素。该毒素性质稳定，不易被蛋白酶及酸破坏，人、畜多因食入此毒素的食品或饲料，而引起食物中毒。1958年新疆发生发酵性豆制品食物中毒，首次证实了肉毒梭菌在我国的存在。在新疆、青海、宁夏和四川等多发地区的土壤中，该菌的检出率为，发酵食品中检出率为。 肉毒毒素也有神奇的一面呦！2007年9月15日 消息(午夜新闻)：卫生部14号晚发出紧急通知：警惕肉毒梭菌食物中毒事件。经调查，在石家庄市乾丰食品、石家庄市东光食品厂、石家庄市独一家食品、定州市新宗食品、饶阳县健民食品厂生产的火腿肠中检测出肉毒毒

2、素。河北省、山西省近日发生的肉毒梭菌食物中毒事件与这些产品有关。引起肉毒中毒的食品大致类型我国主要是家庭自制的发酵食品，如豆瓣酱、豆浆、臭豆腐等。少数发生于各种不新鲜肉、蛋、鱼类食品。日本以鱼类制品引起中毒者较多。美国 以家庭自制罐头和肉乳制品引起中毒者为多。欧洲 多见于腊肠、火腿和保藏的肉类。致病性厌氧条件下可分泌强烈的外毒素肉毒毒素。毒力是目前生物毒素中最强的一种，毒性比氰化钾强1万倍1mg可致死2000万只小白鼠，人的致死量为1g左右；蛋白质，不耐热，对酸性及蛋白酶抵抗力较强pH36时毒性仍保持稳定，不被胃肠液破坏，毒素被人、畜、禽食入后即可发病，出现特征性的神经中毒病症，引起软瘫和麻痹

3、，呕吐腹泻。肉毒毒素C型肉毒中毒多见于鸡及野禽，特别是水禽，且多因吃腐烂植物引起。D性肉毒中毒多见于南非及美国得克萨斯州的牛有异癖者，常因吃已死动物的骨骼动物死尸内曾有肉毒梭菌繁殖。此外，C、D型还见于马、绵羊、水貂饲料中毒。其中A、B、E、F型肉毒梭菌中毒大多数报道见于食用发酵的豆类、肉及肉制品、鱼罐头、鱼罐头及生鱼等。中毒机理毒素经胃肠道进入血液，作用于神经及神经-肌肉接头处，以及植物神经末梢。阻碍了乙酰胆碱的释放，因而引起胆碱能神经支配的肌肉和骨骼肌麻痹，产生病症及死亡。根据肉毒毒素的抗原性，可将肉毒梭菌分为： A、B、C、D、E、F、G等7个型，其中C型还可分为C和C两个亚型。微生物学

4、检验肉毒梭菌中毒为毒素中毒，故从患者体内或残留食物中查出肉毒毒素是最有价值的，而肉毒梭菌的别离培养仅作为诊断的辅助手段。对毒素的检测以动物试验方法开始较早，多种动物对肉毒毒素均很敏感，其中价格低廉且敏感性最高的是小白鼠。检样食品毒素检测增菌、产毒培养，30，5day报告一毒素检测报告二观察生长性状、染色特性别离培养观察菌落性状、染色镜检增菌产毒培养，30，5day毒素检测培养检查报告三肉毒毒素检测明胶磷酸盐缓冲液成分明胶 2g磷酸氢二钠 4g蒸馏水 1000ml液状检样可直接离心，固体或半固体检样须加适当明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。另取一局部上清液，调，每9份加1

5、0%胰酶活力1：250水溶液1份，混匀，不断轻轻搅动，37作用60min，进行检测。检出试验取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只，观察4天。注射液中假设有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在24h内发病、死亡。主要病症为竖毛、四肢瘫痪，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛假设蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以及病症不明显时，那么可将注射液做适当稀释，重做试验。确证试验不管上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成三份进行试验。一份加等量多型混合肉毒毒素抗诊断血清，混匀，37，作用30min。 一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min。三份混合样分别注射

6、小白鼠各两只，每只，观察4天，假设注射加诊断血清与煮沸加热的两组混合物的小白鼠均获保护存活，而注射未经其它处理的混合液的小白鼠以特有的病症死亡，那么可判定检样中的肉毒毒素存在。定型试验按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10 MLD/ml-1000 MLD/ml的范围，分别与各单型肉毒毒素抗诊断血清等量混合，37，30min，各注射小鼠2只，每只，观察4天。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样所含肉毒毒素的型别肉毒梭菌检出取疱肉培养基三支，煮沸1015 min，做如下处理：急速冷却，接种检样均质液12 ml冷却至60 ，接种检样，继续于60 保温10

7、min，急速冷却。接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。以上接种物30培养5天，假设无生长，可再培养10天。培养到期，假设有生长，取培养物离心，以其上清液进行毒素检测试验，阳性结果证明检样中含有肉毒梭菌。肝块肉汤成分牛肉膏 20g酵母浸膏 4g蛋白胨 4g磷酸氢二钠 3g可溶性淀粉 1g蒸馏水 1000ml配制煮熟，过滤分装。另将牛肉肝煮熟切成约34mm见方的小块，每一试管放入35个小块121，2030min灭菌别离培养选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物接种卵黄琼脂平板，35 厌氧培养48 h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上时，菌落及周围培养基外表覆盖着特有的虹彩样或珍珠层样薄层，但G型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态跳取可疑菌落，接种疱肉培养基，于30培养5天，进行毒素检测及培养特性确证试验。预 防在食物原料保存运输中防止污染。在制作过程中加温要充分，足以杀灭肉毒梭菌芽孢。肉毒梭菌芽孢耐热性强，但肉毒毒素并不耐热，食物在食前，蒸煮3060分钟，可以破坏毒素。对生产发酵食物、罐头制品或腌制品的