激素测定原理

1、由内分泌腺和内分泌细胞合成和释放的各种激素(hormone)，随血液循环运送 到相应的靶器官或靶细胞，调节其代谢或功能，由于不同于通过腺管的外分泌腺 体，故称为内分泌(endocrine)。一些内分泌细胞分泌的物质也可通过自分泌 (autocrine)或旁分泌(paracrine)的方式发挥作用。机体主要的内分泌腺包 括垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、胰腺和性腺，由其所分泌的多种激素对调 节各系统、器官、组织和细胞的代谢，维持内环境的稳定起重要作用。内分泌系 统通过精细的调节机制来维护机体各系统的功能协调和内环境的稳定，一旦出现 任何偏离，如内分泌腺破坏、功能亢进、激素合成缺陷，使激素分泌过多

2、或过少； 或激素受体和(或)受体后缺陷、激素抗体出现等使对激素的敏感性异常，导致 多系统甚至全身代谢或功能失衡，引起内分泌疾病。内分泌疾病的实验诊断主要 包括：检测血液或体液中激素及其代谢物水平或转运蛋白的浓度；对某些内 分泌腺特有的生理功能、调节代谢的对象进行检测；动态功能试验；此外，寻 找代谢紊乱证据对协助诊断也十分重要，部分疾病还应检查自身抗体等。但是， 影响内分泌疾病实验诊断的因素很多，如生物节律性变化、年龄、药物、妊娠等， 而且标本采集的时间、身体姿势和运动状态、饮食和生活习惯及实验方法等均可 对检测结果的评价产生影响。因此，在诊断内分泌疾病时，实验检查结果应密切 结合临床进行分析。

3、目录-内分泌激素的测定方法-甲状腺激素及有关蛋白测定-甲状旁腺素与降钙素测定-肾上腺皮质激素测定显示部分显示全部内分泌激素的测定方法编辑本段回目录激素测定法(methods of hormone determina-tion)对体液或组织中激素 含量的测定方法。按照世界卫生组织分类原则，可把激素测定方法分为生物鉴定， 化学测定，蛋白结合测定和细胞化学测定4类。生物鉴定以样品中所含激素引起动物的某些特异生物反应为基础的测定方 法。是20世纪20年代发展起来的。例如，胰岛素降低血糖；雄激素引起阉鸡鸡 冠生长;雌激素使啮齿类动物阴道上皮角质化；甲状腺激素可以促进蝌蚪变态等。 生物鉴定有两个特点：活体

4、注射；以生物反应作为鉴定指标。因此，对鉴定 条件的严格控制十分重要。如给药途径、注射剂量、溶剂和悬浮液的性质，动物 种类、年龄、性别和健康状况等。此外，所选终点反应指标应为特异反应。如肾 上腺素能升高血糖，但不能依此指标来鉴定肾上腺素。因为胰高血糖素、促肾上 腺皮质素、肾上腺皮质激素也可通过不同作用途径引起血糖上升。此外，各种激 素在体内的反应可能是多途径的；不同动物对同一激素的反应也可能有所不同。 由于这些复杂情况在选择生物鉴定的最终反应指标时，必须要考虑其客观性、精 确性、灵敏性、特异性、重复性和方便性。测定技术应立足于仪器的客观测定， 而不是依赖于主观估计。如性甾体激素能改变人的体型和毛

5、发分布，但这些指标 难以客观测定。生物鉴定的优点是反应特异的生物活性，能真正代表激素的生物效应，所以 它是一切测定方法的基础。生物鉴定的缺点是灵敏性差；动物用量大；实验延续 时间长，难以鉴定多量样品。化学测定20世纪40年代随着化学技术的发展，对一些小分子激素（如甾 体激素）的分子结构以及它们的代谢产物有了比较明确的了解，在此基础上发展 起来的以激素或代谢产物分子上的特异基团同某种试剂的显色反应为基础的测 定方法。它只能测定一些小分子化合物，灵敏度比生物鉴定高但操作程序复杂， 使用不普遍。蛋白结合测定目前最通用的一种激素测定方法，也是命名最混乱的一种测 定方法。通常用的免疫测定法，放射免疫测定

6、法，受体结合测定法和血浆蛋白结 合测定法，都属于这一类测定方法。世界卫生组织根据其测定原理对蛋白结合测 定法提出新的分类标准和统一命名。这些分类标准包括：在测定中是否需要标 记物；标记的是被测物还是结合蛋白；在测定系统中被测物过量还是结合蛋 白过量；测定的是被测物本身（直接法）还是结合蛋白（间接法）；在测定 系统中是否需要分离步骤。据上述标准，以免疫测定为例，介绍几种测定方法：不用标记物的蛋白结合测定法一一免疫测定法基于被测物（抗原）与其特 异结合蛋白（抗体）结合时所出现的沉淀线作为测定指标的，在测定系统中加入 的抗体是过量的。操作较为迅速和方便。但这一测定法只适应于测定大分子物质， 被测物的

7、浓度较高，只有这样才形成能用肉眼看到的抗原-抗体复合物，这类方 法应用较少。标记抗原的免疫测定法放射免疫测定法这是以标记抗原和未标记抗原 与同一抗体的竞争性结合反应为基础的。随着未标记抗原增加，在反应系统中复合物中标记的抗原越来越少，因而在 仪器上所测到的放射性记数也越来越少，由此可以作出一条标准曲线，并从标准 曲线上查出被测样品的含量。放射免疫测定法既能测定蛋白质类的大分子物质， 也能测定半抗原一类的小分子物质。放射免疫测定法的灵敏度高，样品用量少， 并便于自动化操作。放射免疫测定法属结合蛋白（抗体）限量测定，标记的是被 测物（抗原），所以它属于直接测定。标记抗体的免疫测定免疫放射计量测定法

8、这是标记特异抗体。在反应系统中加入过量的标记抗体以便使全部被测抗原与之结合，然后，将结合和未结 合的抗体分开。用吸附剂除去未结合的抗体，因此最后在仪器上测到的是结合型 的抗体，这是一种间接测定，并且是一种过量蛋白结合试剂测定法。它与放射免 疫测定法有本质上的区别。过量蛋白结合试剂测定法反应迅速，反应更为灵敏， 但特异性较差。为了克服这一不足，有人发展了一种夹心面包免疫放射计量测定 法，大大提高了特异性和灵敏度。非同位素标记的免疫测定除用同位素作标记物之外，还有许多化合物可用 作标记物。如酶、荧光素、病毒、金属、红细胞、乳酸和其他许多特异显色颗粒。 非同位素免疫测定的命名可按放射免疫命名的格式来

9、表示。如：放射免疫测定、 酶免疫测定、荧光免疫测定和病毒免疫测定等。用非同位素标记抗体的免疫计量测定，也可仿照免疫放射计量测定法的命名 来表示。如：免疫酶计量测定；免疫荧光计量测定。以上仅仅以抗体作为结合试剂为例命名，对以其他结合蛋白为结合试剂相似 的测定，也可以同样格式命名。不经分离步骤的免疫测定法猝灭测定差不多所有标记测定法都需要一 种适当的分离步骤，以便把反应系统中最终的结合型和游离型标记物分开进行测 定。但是分离步骤会导致偏差，影响测定结果。有些分离技术需要熟练的技巧。 猝灭型测定法一般用于测定半抗原化合物。其基本原理是，先将标记物一一酶与 半抗原分子结合，当抗原同酶结合后在空间构型上

10、发生变化，此抗原与抗体结合 后其酶不再同底物发生作用，酶的活性失效（或称作猝灭）。细胞化学测定放射免疫测定法虽然灵敏度高，操作方便，但所测结果不能 完全代表激素的生物活性，因为激素分子的免疫活性中心和生物活性中心往往是 不一致的。近年有人发展了一种细胞化学测定方法，大大推进了测定技术的发展。许多激素在其靶细胞中，可直接或间接引起一系列氧化还原反应，不同剂量 的激素在靶细胞中所引起的反应程度（或状态），可以通过某种组织化学和细胞 化学方法（对特异酶或反应底物的显色反应）显示出不同程度的染色，这些染色 反应可通过非常灵敏的仪器（微光密度测定仪）定量地记录下来，这就是细胞化 学测定法的基本原理。细胞

11、化学测定，实际上是一种生物测定法，但是，它兼有放射免疫测定法和 生物测定法的双重优点，其灵敏度比放射免疫测定法高5001000倍。血液样品 可作1 : 100或1 ： 1000稀释，每次测定血液用量极微。在测定技术上，现已开 始用组织切片来代替组织块，大大提高了测定效率。此方法的缺点是延续时间长， 并要用贵重仪器和消耗大量干冰，所以难以推广。一、生物测定法是传统的测定方法，它是用动物体内实验或其离体器官、组织、细胞和激素 受体的体外实验，直接测定激素的生物活性，其优点是直接反映激素的生物活性。 该方法是在相同条件下比较待测定样品和标准品产生相同效应的剂量比值。标准 品与待测样品性质要相同或近似

12、，其实验数据要根据生物变异规律和设计原理进 行统计学处理。生物活性测定包括以下几种方法：（一）动物体内的测定方法是用整体或切除某一内分泌腺体的小鼠、大鼠、豚鼠、猫、犬和兔等动物，按规 定剂量及途径给予动物标准品和待测样品，根据产生同样生物效应，比较标准品 和待测样品比值，推知待测样品的生物活性。该方法适用于药用激素测定。其优 点可直接反映激素的生物活性，而其缺点是标本量大、动物多，受动物种属、来 源、体质、年龄及性别等因素影响反应的灵敏度和准确性。（二）细胞生物化学方法不仅保持生物活性，并且可定量测定。（三）离体细胞培养测定生物活性法是通过体外培养原代细胞或细胞株，加入激素标准与激素样品，产生

13、的生物 功能改变，得知激素样品的生物活性，该方法适于小样品激素活性的测定，是研 究激素功能与结构关系及其影响因素的较好方法。（四）放射受体分析法（radioreceptor assay,RRA）是利用过量的放射性核素标记配体和非标记的配体，如激素的放射性核素标记物 和激素样品在一定条件下，竞争有限的特异受体结合位置的方法。利用放射受体 分析法计算激素受体的相对结合亲和力，可以推知待测样品有无激素生物活性。 RRA方法只代表激素与受体结合亲和力，并不能准确反应激素结合后的生物活性, RRA值与生物活性是成正比关系。二、免疫测定法（一）凝集试验是利用颗粒抗原直接与抗体反应发生凝集现象称为直接凝集反

14、应。若将一些 可溶性抗原（或抗体）吸附在惰性颗粒载体表面上，与相应抗体（或抗原）发生 凝集反应，称作间接凝集反应。抗原与颗粒载体相连接的称正向间接凝集反应。 抗体与颗粒载体相连接的称反向间接凝集反应。这种方法用于早孕诊断的快速免 疫胶乳法和羊红细胞血凝抑制试验。（二）免疫比浊法此法分为两种，一种是胶乳比浊分析，是利用直径在15600nm的化学胶乳颗粒 作为抗原的包被物，提高抗原和抗体的结合物的浊度，用光度计可直接测定，灵 敏度可达10 8mol/L。另一种是直接比浊法，是使抗原和抗体的复合物在溶液中形成足够大的沉淀颗粒，可以用透射光或散射光比浊法分析，其灵敏度在 10 810 3mol/L,上

15、述方法用于血清、尿或脑脊液中含量较高的特殊蛋白测 定。（三）标记免疫测定它可分为抗原过量分析法和抗体过量分析法。在抗原过量分析法又分为放射性免 疫分析法和非放射性免疫分析法1 .抗原过量分析法（饱和分析法或称竞争抑制分析法），其基本反应是标记抗 原与未标记抗原竞争有限抗体或特异结合剂上的结合位点。（1）放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA）：是将同位素分析的灵敏性和抗 原-抗体反应的特异性的两大特点结合起来的一种微量测定技术。其原理是标记 抗原与其特异抗体反应，产生标记抗原-抗体复合物，反应物与产物保持着可逆 的动态平衡。如果在反应系统中同时存在非标记抗原，且标记与非标记抗

16、原对于 抗体是具有同样的亲和力，当抗体与标记抗原的量都是恒定时，抗原和标记抗原 之和大于抗体上有效结合点的数目时，根据同位素稀释原理，随着抗原浓度的增 加，标记抗原和抗体的复合物数量相应减少，则抗原与标记抗原和抗体的复合物 之间存在着函数关系。因为标记抗原对抗体结合被未标记抗原的竞争结合所抑制, 故产生一条抑制曲线。这条曲线反映了标记抗原结合程度或游离程度或者是二者 之比与未标记抗原的函数关系，这一条曲线就是对样品进行定量的依据。RIA方 法广泛应用于内分泌的各种激素，包括蛋白质、多肽和类固醇激素的测定，但必 须记住“免疫反应”与生物活性并不是同义词，具有免疫反应部分，不一定具有 生物活性。（

17、2）非放射性免疫测定法：是应用非同位素标记物，如酶标记物适用于样品中 含有较高的被测物浓度的免疫测定法，还有一些非同位素标记物，如化学发光及 荧光标记物，具有的灵敏度超过同位素标记物。应用这些非同位素标记物建立的 免疫分析法有酶免分析法（enzyme immunoassay,EIA）、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）及时间分辨荧光免疫分析法。酶免 疫分析（EIA）是将酶催化放大作用和抗原与抗体免疫反应的特异性相结合的一 种测定方法。根据测定过程中是否需要将结合的酶标记物和游离的标记物分离， 而分为均相分析与非均相分析两类。均相测定中由

18、于免疫反应后有酶活性改变， 不需将游离和结合的酶标记物分开。该方法操作步骤简单、快速，灵敏度为10 9mol/L,主要用于小分子半抗原测定，但因受样品中非特异干扰物影响，其灵 敏度不如非均相EIA高。非均相EIA分为竞争性和非竞争性两大类，竞争性非 均相又分为酶标记抗原和酶标记抗体的EIA。酶标记抗原与抗原相互竞争有限抗 体结合，洗去游离抗原和酶标记抗原，测定固体抗体结合的酶标记抗原的酶活性， 即可测得被测物量。此法快速，非特异性结合低，但灵敏度不如RIA高。酶标抗 体EIA是用酶标记抗体作为示踪剂，使标记抗体和未标记抗体竞争同固相抗原结 合，固相抗原结合的酶标抗体同被测抗体的浓度成反比，测定

19、固相抗原结合的酶 标抗体的酶活性，即可定量测定被测抗体浓度，其灵敏度同RIA。2 .抗体过量分析酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)： 是非竞争性、非均相的酶免疫分析法或称夹心EIA,它是抗体过量分析法，其基 本原理是使用两种抗体，一种作固定抗体，另一种作酶标抗体，被测抗原可同时 与两种抗体结合，夹在两种抗体之间，这种双位点夹心原理明显提高了测定特异 性和灵敏度，目前被广泛应用。免疫放射分析法(immunoradiometric assay,IRMA):是应用双位点，非竞 争性结合和过量抗体的免疫放射分析技术，其基本原理是选择一

20、对各自与被测抗 原分子上不同位点结合，彼此完全互不干扰的单抗，其中一种作为固相抗体，另 一种抗体用放射性核素标记，作为被测抗原进行特异性定量指示剂，经过免疫反 应，根据固相载体上抗体-抗原-标记抗体结合物的放射活性，可知被测物抗原的 含量。这种方法特异好、灵敏度高、快速、简便，但不适于小肽和类固醇激素， 因为小分子物质很难获得抗两个不同结合位点的单抗。荧光免疫分析(fluorescence immunoassay,FIA)是将荧光素标记在抗体 或蛋白质抗原上作为示踪物，根据相应抗原或抗体结合原理，测定结合的或者游 离的荧光强度，即可知被测抗体含量。由于荧光测定中受操作系统的本底荧光的 干扰及激

21、发光源散发光的影响，方法稳定性差，灵敏度也受限，进一步创建了以 镧系元素螯合物作为示踪物的免疫测定方法称时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,Tr-FIA)这种方法消除非特异本底荧光的 干扰，提高方法特异性和灵敏度，且标记化合物稳定、方法简单、快速。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将化学发光分析和免疫反应相结合的一种新型超微量分析技术。其检测原理与 放射免疫(RIA)和酶免疫分析法(EIA)相似，不同之处是以发光物质代替同位 素或酶作为标记物，或以发光试剂作为相应底物，并借助其发光强度直接

22、进行测 定。其测定方法可分为使用限量的特异性抗体进行竞争结合分析，也可应用过量 的标记抗体做非竞争结合分析。发光反应系统中是以化学反应为基础的，该系统 是由发光化合物、氧化剂、催化剂组成，不同发光体系的反应条件、发光强度和 波长等均有差别，所以出现了许多种方法，如化学发光免疫测定法、化学发光酶 免疫分析法、化学发光ELISA等，这些方法具有无污染、稳定、快速及超微量分 析等优点，被广泛用于抗原、半抗原和抗体的检测。免疫测定方法已广泛应用于各个领域，其中在妇产科用来测定雄激素(睾酮、双 氢睾酮、脱氢异雄酮、雄烯二酮)、雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇、雌四醇)、 孕激素(孕酮、17 口-羟孕酮)、人

23、绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、促黄体 生成素、促卵泡生成素、性激素结合蛋白、生长激素抑制素、泌乳素等激素的测 定。在妇科肿瘤疾病诊断中也广泛应用。肿瘤标志物的检测方法肿瘤标志物(tumor marker)是肿瘤组织和细胞由于癌基因或抑癌基因和其 他肿瘤相关基因及其产物异常表达所产生的抗原和生物活性物质，在正常组织和 良性疾病时，几乎不产生或产量甚微，可在肿瘤患者组织、体液和排泄物中检出， 它反映了癌的发生和发展过程及肿瘤相关基因的激活或失活程度。此外，在患者 机体内，由于肿瘤组织侵润正常组织，引起机体免疫功能和代谢异常，产生一些 生物活性物质和因子，虽然这些物质和因子特异性低,但与肿瘤的发生

24、发展有关， 也可用于肿瘤诊断，故也将其称为肿瘤标志物。肿瘤标志物可分为两大类，即由 肿瘤组织产生及肿瘤与宿主相互作用而产生的两类肿瘤标志物。前者包括分化抗 原（淋巴细胞表面标志物）、胚胎抗原、同功酶、激素、组织和器官特异抗原、 癌基因和抑癌基因及其产物、癌基因病毒的整合DNA、糖蛋白或其他糖蛋白或糖 脂、多胺及唾液酸等。另一类宿主反应标志物包括血清铁蛋白、免疫复合物、急 性期蛋白、同功酶、白细胞介素-2受体、肿瘤坏死因子及新喋呤等。检测肿瘤 标志物除一些血清酶可用测定活力的方法定量外，对无酶活力的蛋白类或其它肿 瘤标志物大多需用免疫法测定。现有的肿瘤标志物主要用于辅助临床诊断、观察 治疗反应、

25、尽早发现肿瘤复发、转移及预后判断等。但目前还没有任何一种标志 物是对肿瘤绝对特异的，因为某些良性病变也可出现不同程度阳性反应，所以， 肿瘤标志物检测结果，必须结合临床分析，才能得到正确诊断。三、分子生物学的应用传统的疾病诊断方法大致有三种即临床学诊断、血清学诊断及生化学诊断，这些 方法都是以疾病的表型改变为依据的。在大多情况下表型改变出现的时间较晚， 且不是很特异，使明确诊断有一定困难。因此，应用基因诊断，直接探查基因存 在和缺陷，从而对人体状态和疾病作出诊断。按其原理分为三大类：DNA探针技 术、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术和二者结合的技术。

26、 DNA探针技术包括Southern印迹杂交、检测DNA图谱、Northern印迹杂交主要 检测mRNA而不是DNA、点杂交、液相杂交、夹心杂交、寡核苷酸探针技术及原 位杂交。聚合酶链反应（PCR）技术包括：PCR结合斑点杂交检测基因点突变。PCR结合酶解DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLPs）作为遗传标志，进行缺陷基因的连锁分析和产前诊断。 多重PCR快速检出基因中的缺失及点突变。PCR产物的直接测序。基因诊断是 一种强有力的诊断方法，它已广泛应用于产前诊断，单基因病或多基因病诊断以 及基因治疗遗传病都有很大进

27、展。四、生物芯片技术在医学中应用生物芯片（biochip或bioarray）是根据生物分子间特异相互作用的原理， 将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其 他生物成分的高通量快速检测。主要是通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、 genomic DNAx多肽、抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、 凝胶、尼龙膜等固相介质上，形成的生物分子点阵。在此类芯片的基础上，又发 展出微流体芯片（microfluidics chip）或称微电子芯片（microelectronic chip） 即为微缩实验芯片（lab-on-a-chip）。目前最常见的生物芯片是基因芯片（gene chip；又叫DNA chip，DNA microarray），其中基因表达谱芯片的应用最为广 泛，这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA