《转基因食品与安全》课件第五章 转基因食品的检测和分析

1、第五章 转基因食品的检测和分析转基因食品的检测和分析：是指对深加工食品和食品原料种的转基因成分进行检测。检测主要针对其中的DNA、蛋白质或脂肪酸等成分。基于DNA的检测方法可分为两类：DNA杂交法：Southern、Northern、Western基于PCR的检测方法第一节 转基因阳性个体的分子鉴定一、PCR技术（一）标准PCR 1. 优点 快速、灵敏、费用低，检测仅需微量DNA，可同时检测多个样品。 PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 。 PCR反应包括三个步骤： 变性：在94-95使模板DNA的双链变性成单链。

2、复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60 延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互补链 这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。2. 程序提取待测样品DNA 设计引物、进行PCR PCR产物凝胶电泳检测（1）提取DNA：经琼脂糖凝胶电泳检测完整性（2）引物设计 外源DNA 目的基因启动子： CaMV 35S终止子: Nos 大多数转基因作物的启动子是CaMV35s，来自花椰菜花叶病毒DNA，终止子为Nos，来自植物细菌，PCR检测是对启动子、终止子的检测。（3）琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。 扩增条带的分子量与理论上应产生的

3、分子量相同，则说明被检测对象的基因组中含有外源基因。例如：转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株） （二）定量PCR法可知样品中含有多少量的外源基因。如：竞争性PCR技术。二、斑点印迹法 原位杂交：利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。提取DNA 转移至硝酸纤维素膜上 以转入基因的片断作为探针 放射自显影杂交概念：探针：用化学方法将有识别能力的物质（如抗原、一段与目的基因互补的核酸序列）与酶或同位素结合成复合物

4、作为探针。固相载体：用于吸附生命大分子物质的固体材料。印记：把经凝胶电泳后的组分，通过吸附或电泳方法转移或者直接吸附到固相载体上的过程。三、Southern 杂交提取DNA 内切酶消化 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜 探针 杂交放射性自显影如果膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。 Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。电泳Southern 杂交 1975 E. M. Southern 1977. J.C. Alwine 1

5、978. Hany Towbin 原位分子杂交 (In situ hybridization ) Southern blotNorthern blotWestern blotS.S. DNA S.S. DNA S.S. RNA S.S. DNAProtein (antigen ) antibodySouthern BlottingNorthern blotWestern Blotting FISH第二节 外源基因的表达 一、转录水平的检测（一）Northern 杂交 是确定外源基因是否被转录的有效方法。 Northern印迹杂交（Northern blot）。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到

6、硝酸纤维素膜上的方法。 DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern杂交是一种RNA-DNA杂交。 将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上； 将它们原位转移到固相膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交； 然后通过探针的标记性检出杂交体。Northern杂交/v_show/id_XMTQ1NDg1NDcy.html（二）RTPCR RT-PCR

7、为反转录RCR或实时PCR共同的缩写，是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。二、翻译水平的检测 可以检测具有抗原性蛋白类表达产物的存在。（一）免疫检测技术 1. Western杂交 是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白测定法。 从转基因植物中提取总蛋白质，经纯化处理后，进行SDS(十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子量大小分离，将凝胶上的蛋白质转移到膜上，按特定的程序与抗体杂交，对杂交结果进行检测便可得知被检植物组织内目的蛋白表达与否及其表达量。Western杂交加入特

8、异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗结合的带标记的二抗，最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶）的特异性反应进行检测。抗体（Antibody，Ab）： 是高等动物体在抗原刺激下产生的一类 能与抗原特异结合的活性物质。抗体具有双重性（它既是抗体又是抗原），即抗体又可以作为抗原。 一种抗体作为抗原刺激机体产生的新抗体叫抗抗体。Western 杂交 提取待测样品蛋白质 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 蛋白质印迹（将蛋白质由凝胶转移至固相膜上） 制备探针杂交与检出2. ELISA法 （酶联免疫吸附法）原理：将抗原或抗体用小分子的标记剂如荧光素、酶、放射性同位素等

9、加以标记，借以提高其灵敏度的一类新技术。 ELISA是一种免疫测定。加入反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。优点：快速、方便、重复性好。缺点：只能对某一特定蛋白进行检测。间接免疫吸附测定法： 已知抗原吸附在微孔板内 加待检抗血清（含抗体） 加酶联抗抗体，与已吸附的抗原抗体复合物相结合 加入该酶底物 反应终止后依底物颜色深浅，可知样品中抗体的含量。双抗体夹心法原理酶标板（ 96孔聚苯乙烯微孔板）酶联免疫吸附法（ELISA）双抗体夹心法 ： 是测定待测样本中是否含有抗原的方法：1） 将含已知抗体的抗血清吸附在微孔板上，形成固相抗体。

10、2） 加待测抗原，保温反应。形成固相抗原抗体复合物。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 样品中土霉素的ELISA检测 样品 1 2 3 4 5 CK OD 1.91 1.45 1.96 1.48 1.03 2.74 OTC量 0.056 0.457 0.021 0.109 2.952 （二）生物化学性质和生物学活性分析通过定性和定量测定表达产物的生物化学性质和生物学活性，以鉴定表达产物的存在。如: 酶活力测定，受体蛋白分析，激素活性的检测。转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转基

11、因抗虫棉，右图为非转基因棉） 第三节 基因芯片技术基因芯片：指将大量的靶基因或寡聚核苷酸片段通过机械手有序的、高密度的排列在玻璃、硅或尼龙膜上，制成芯片。传统的转基因食品检测方法待测样品的制备食品中DNA的提取食品中核酸的定量转基因食品PCR检测体系引物的设计定性定量PCR扩增反应结果分析传统的转基因食品检测方法的缺点血清学和PCR检测技术在大部分情况下一次实验只能检测一种目标分子，并且检测过程复杂，效率较低。生物芯片（biochip）也称微列阵（microarray）,就是在一块玻璃片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品，然后由一种仪器收集信号，用计算机分析数据结果。生物芯片技术是随着人类基因

12、组计划（HGP）的进展而发展起来的，它是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片的种类 生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。 所有的生物芯片技术都包含四个基本要点：芯片的制作、杂交或反应、测定或扫描、数据处理。生物芯片的技术核心是芯片的制备及反应信号的检测。 基因芯片基因芯片，又称DNA芯片，包括寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片。理论基础是杂交测序，即利用核酸杂交的原理检测未知

13、分子。在硅胶、玻片等固相载体上按特定排列方式固定大量核酸探针或基因片段，与标记的待检测样品进行杂交，通过检测标记物信号得到杂交结果，利用计算机分析从而获得大量信息。基因芯片检测原理 cDNA芯片可以检测待测样品中是否有与之互补的序列。 将待测样品中的mRNA被提取后，通过反转录反应过程获得标记荧光的cDNA，与包含上千个基因的cDNA微阵列进行杂交反应16h后，将玻片上未互补结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定微阵列上各点的荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平。转基因食品的检测： 把现有的转入作物体内的基因片断制成芯片 提取待测植物的RNA 在反转录中标记cDNA 与检测芯片杂交 分析结果特点： 机械化程度高，检测结果准确可靠，但检测成本高，对技术要求较高。 该技术在转基因食品检测中有广阔的前景。Western 杂交原理 从生物细胞中提取目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中