微生物学实验指导资料

1、微生物实验守则微生物学实验的目的是：加深对微生物学理论知识的理解；扎实掌握实验的基本操作，并牢固建立无菌操作的概念；培养学生认真观察、发现问题、分析问题和解决问题的工作能力；树立学生实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、协作攻关的优良作风。为了提高教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项。每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法，熟悉实验操作中的主要步骤和环节。非必要的物品不要带入实验室，必须带进的物品应放在不影响实验操作的地方。实验时认真听教师的讲解，仔细观察示范操作。许多微生物有潜在的致病能力。实验中要严格无菌操作，以免培养的微生物进入外界环境，并保证所

2、培养的微生物不受污染。实验室内严禁餐饮。实验前洗手并用酒精棉球擦拭手和台面。实验操作过程中，要严格进行无菌操作，以防止菌体间交叉感染或致病菌对人体造成危害。在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流，要尽量减少走动和讲话，以防止尘埃飞扬和唾 沫四溅。用过的带菌吸管、滴管、玻片、涂布棒和移液器枪头等，用酒精或来苏尔等浸泡以后再进行清洗。离开实验室之前要用肥皂洗手。实验室中的菌种和物品等，未经教师允许，不得携带出实验室。凡需进行培养的材料，都应注明菌种名、接种日期、处理方法及操作者姓名（或组别） ，放在制定的培 养箱中进行培养。如发生培养菌的器皿打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况时，应立即报

3、告指导教师，及时处理，菌液污染实验台面或其他物件时，应及时用3的来苏尔或5的石炭酸液擦拭消毒。爱护仪器、设备，严格按照操作规程使用仪器、设备，以确保仪器的安全和学生的人身安全，并做好使用记录，确保仪器的正常使用。按时观察实验现象，认真及时的做好实验记录，对于当时不能得到实验结果而需要连续观察的，则需记下每次的实验结果，以便分析。清晰填写实验报告作业，科学阐述实验结论。节约水、电，适量取用药品等耗材。实验结束后，应将实验记录交指导教师审阅及检查，经同意后方可结束实验。实验完毕，认真清洗个人器皿、保养仪器、清理试剂和清洁台面，确保实验以后各种药品和仪器回归原位，台面干净整洁。值日生负责打扫实验室卫

4、生及检查实验室安全状况（门窗、水、电、煤气等） 。实验一微生物学实验基础一、目的要求.熟悉实验室的各种仪器与设备。.学会制作棉塞的与包扎玻璃器皿，了解玻璃器皿的洗涤方法。 二、实验材料实验室内各种仪器、培养皿、三角瓶、试管、纱布、棉花、棉线、牛皮纸、剪刀等。三、实验内容（一）微生物实验室常用仪器和设备.显微镜显微镜是微生物实验中常用的仪器，应对它非常的熟悉。根据光源不同，显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（或者紫外光）为光源, 后者以电子束为光源。在我们的实验中常用的是光学显微镜。光学显微镜有多种，主要有普通光学显微镜、 荧光显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜等。在我们的实验

5、中最常用的是普通光学显微镜，下面介绍它的主要构造。（1）普通光学显微镜构造此类显微镜的构造主要可分为两部分：机械部分和光学部分。显微镜的机械部分包括镜座、镜臂、镜 筒、转换器、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配合和灵 活调控。光学部分由物镜、目镜、聚光器、光源、反光镜等组成，它们直接影响显微镜的性能，是显微镜 的核心部分。图1-1显微镜的构造图（2）普通光学显微镜的使用方法:取镜安放:取镜：右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立。（特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜 筒中滑脱）。安放：放置桌边时动作要轻。一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂

6、向后，距桌边710 cm处，以便观察和防止掉落。低倍镜的使用：观察任何标本都必须先用低倍镜。放置切片：升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用压片夹压住载玻片的两端。调焦：将要观察的玻片标本放在载物台通光孔的中央，玻片标本两端用压片夹夹紧，再用手沿顺时针方向旋转粗调节器，把镜筒徐徐降到接物镜头差不多接近玻片标本（约半厘米）为止 （从侧面观察下降镜筒） 。然后左眼观察，边观察边用调节器将镜筒徐徐上升（逆时针方向旋转粗调节器）直到发现物象，观察清晰为止。如果不够清楚，可用细准焦螺旋调节（ 不可以在调焦时边观察边使镜筒下降，以免压碎装片和镜头） 。低倍镜的观察 由所用的目镜放

7、大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数。如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节。高倍镜的使用选好目标：如果要观察视野内某部分更细微的结构，则需要用高倍镜观察。先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央。转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜。再用粗调节器徐徐将镜筒距离调整，至视野中出现物象，然后用细调节器调节到看清物象止 （用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片） 。调焦：在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像。在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要

8、重新调节视野亮度，可升高聚光器或利用凹面反光镜。油镜的使用高倍镜下观察的标本，如果放大倍数还不够，可用油镜，换用前，同样要先在高倍镜下观察，把要观察的部分放在视野的正中央。观察到清晰的物象之后，在盖玻片上表面的中央滴一小滴香柏油，再换上油镜头，使油镜头与香柏油接触，然后由目镜观察。一边观察，一边用手稍移动细调节器（切忌用粗调节器）以看清物象。用油镜观察完毕后，转开油镜，必须用擦镜纸点二甲苯擦去镜头上的香柏油。下降镜筒，直立反光镜，使光学部件的光线不再对在一条直线上。应当了解的是，在显微镜中观察到的物象是倒象，因此移动玻片时，应注意移动方向。如果要使物象左移动就要向右移动玻片，同样要使物象向前移

9、动，就要向后移动玻片。使用后的整理观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作。清洁完毕，再下降镜筒，使物镜和载物台处于最大距离处，然后移动转换器，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，呈“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩，仍用右手握住镜臂， 左手平托镜座，按号放回镜箱中。（ 3 ）显微镜的保养取送显微镜时，必须右手握住镜臂，左手托住镜座，轻拿轻放。显微镜的使用，一定要按实验指导写的方法和步骤，认真仔细去做，不然，容易损坏标本和镜头，又达不到看清物象的目的。观察标本时，一定要先用低倍镜观察，再用高倍镜，低倍镜能看清，就不必用高倍

10、镜。不能用硬纸擦透镜，必须用干净的擦镜纸，朝一个方向擦拭透镜，以免损坏镜头。不要随便转动粗细调节器，以免机器损伤，调节失灵。载物台要保持清洁、干净，不要让水或其他液体（酸、碱或其他化学药品等）流到台上，以免生锈或腐蚀。避免阳光直接照射，要防潮湿、防灰尘，经常保持镜体和镜体箱的干燥和清洁。2、高压蒸汽灭菌锅应用最广、效果最好的灭菌器是高压灭菌锅。用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、玻璃器皿等的灭菌。其种类有手提式、直立式、横卧式等（图 1-2）,他们的构造及灭菌原理基本相图1-2-1手提式高压蒸汽灭菌锅图 1-2-2图 1-2-3图 1-2-4立式高压蒸汽灭菌锅普通卧式高压蒸

11、汽灭菌锅圆形卧式高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅主要构造为一双层金属圆筒，两层之间盛水，外壁坚厚，上方或前方有金属厚盖， 盖上装有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而锅内压力可升高，其温度也相应增高。高压蒸汽灭 菌锅还装有排气阀，用来调节灭菌锅内蒸汽压力与温度，并保障安全；高压蒸汽灭菌锅上还装有温度压力 表，指示内部的温度和压力。3、超净工作台是进行微生物无菌操作的工作台，它能在局部形成高净洁度的环境。其工作原理是借助鼓风机将外界 空气强行通过一组过滤器，净化的无菌空气连续不断地进入操作台面，并且台内设有紫外线杀菌灯，可对 环境进行杀菌，保证了超净工作台面的正压无菌状态。4、培养箱培养箱又称保

12、温箱，是培养微生物的主要仪器。培养箱一般为方形或长方体形，外壳是喷漆的铁皮或优良塑料材料，内壁为铝板，夹层填充石棉或玻 璃棉等绝缘材料以防止温度扩散。内层底部安装电阻丝用以加热，利用空气对流，使箱内温度均匀。5、干燥箱干燥箱又称烘箱，是一种常用于物品干燥的仪器，加热范围一般为30-300 C。不同类型的干燥箱由于用途、要求不同，构造略有差异。其构造与传统的培养箱基本相同，只是底层下的电热量大。主要用于玻 璃仪器的灭菌，也可用于洗净的玻璃仪器的烤干。6、离心机离心机的主要用途是使液体标本达到离心沉淀的目的。其原理是利用离心力的作用，将浊液固液分离。（二）棉塞的制作与玻璃器皿的包扎1、棉塞的制作常

13、用的棉塞有试管塞和三角瓶塞，其制作方法基本一致，具体步骤见图1-3。图1-3棉塞的制作合格的棉塞图1-2合格与不合格棉塞的对比图不合格的棉塞2、玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洁与否，常会影响实验结果的准确性，所以在使用之前，对玻璃器皿要进行洗涤。（ 1）新玻璃器皿新玻璃器皿含有游离碱，初次使用时，应先在2 的盐酸水溶液内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。（ 2）带油污的玻璃器皿可先在 50g/L 的碳酸氢钠液内煮两次，再用肥皂和热水洗涮。（ 3）带菌的玻璃器皿滴管和吸管：投入 3 的来苏水或5 的石炭酸溶液内浸泡数小时或过夜，或经高压蒸汽灭菌后，用自来水及蒸馏水冲净。载玻片及盖玻片： 先浸入3 的来

14、苏水或5 的石炭酸溶液内， 然后用夹子取出经清水洗净， 再放入95的乙醇中，使用时在火焰上烧去乙醇，或用软布擦干使用均可。其他的带菌玻璃器皿：应先经121 高压蒸汽灭菌， 20-30min 后取出，趁热到处容器内的培养物，再用热水和肥皂水刷洗干净，用自来水冲洗。3、玻璃器皿的包扎试验中的各种玻璃器皿常常要进行灭菌处理，为了使灭菌后仍能保持无菌状态、以及防止在灭菌过程中带有样品的玻璃器皿内的蒸汽冲破棉塞，导致器皿内的样品喷溅出来，所以，在灭菌之前对需灭菌的器皿进行包扎。培养皿洗净、干燥后，一般每6 套（可视情况改变数量）叠放在一起，用牛皮纸卷成一筒，外面用棉绳捆扎紧，然后进行灭菌后备用。灭菌后的

15、培养皿，一定要使用时才能打开牛皮纸，以免微生物再次污染。试管洗净、干燥的试管，塞上合格的面塞，面塞入管2/3 ，管外留 1/3 ，同规格的 7 支（可视情况改变数量）用棉绳捆扎在一起，试管上半部分外包纱布和牛皮纸，再用棉绳捆扎紧后准备灭菌，灭菌后，用时再打开。如果试管内有培养基等，应注明。三角瓶三角瓶每个需要单独塞好棉塞，用牛皮纸包扎，用棉绳扎紧后待灭菌。灭菌后，用时再打开。如果瓶内有待灭菌的物质如培养基、生理盐水等，应注明。四、实验报告普通光学显微镜的构造主要分为哪几部分？带菌玻璃器皿怎么洗涤？实验二 染料及培养基的配制技术一、目的要求掌握常用染料的配制技术。掌握配制培养基的一般方法和步骤，

16、熟悉高压蒸汽灭菌锅的使用。二、基本原理染料分为天然染料和人工染料。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，他们多从动植物体内提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。为使他们易溶于水，通常制成盐类。染料可按其电离后染料离子所带的电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四类。酸性染料：这类染料电离后染料离子带负电，可与碱性物质结合成盐，如伊红、刚果红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等。 当培养基因糖类分解产酸而是pH 下降时， 细菌所带的正电荷

17、增加， 这时选择酸性染料，易被染色。碱性染料：这类染料电离后带正点，可与酸性物质结合成盐，如美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿、番红等。在一般情况下，细菌易被碱性染料染色。中性（复合）染料：酸性染料和碱性染料的结合物叫中性（复合）染料，如瑞脱氏（ Wright ）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等。后者常用于细胞核的染色。单纯染料：这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为他们大多都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂类溶剂中，如紫丹类的染料。培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物

18、。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的 pH 范围。不同微生物对pH 要求不一样，霉菌和酵母菌白培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再 混合，或在中性pH条件下灭菌后，再调整pH。此外，由于配制培

19、养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，所以，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分或改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。三、实验材料试剂：美兰、95%乙醇、氢氧化钾、蒸馏水、碱性复红、石炭酸、结晶紫、草酸铵、碘片、碘化钾、番红、孔雀绿、石炭酸、乳酸（ 比重 1 21） 、甘油、棉蓝（即苯胺蓝） ；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖、可溶性淀粉、硝酸钾、马铃薯、葡萄糖、琼脂、蒸馏水等。仪器和器材：电子天平、玻璃棒、烧杯、药匙、称量纸、卫生纸、白色滴瓶、棕色滴瓶、分装漏斗、电磁炉、白瓷杯、试管、三角瓶、高压灭菌锅等。四、实验内

20、容（一）几种常用染料的配制参照附录一、配制吕氏碱性美兰染色液、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、芽抱染色液和乳酸石炭 酸棉蓝染色液。配制完成后，贴上标签，注明染料的种类，配制时间，组别。（二）培养基配制的一般步骤1、计算称量：根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后取少于总量的蒸储水于白瓷杯中， 分别称取培养基成分（除琼脂外），并按顺序逐一加入水中（有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起 容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解；对于酵母膏和牛肉膏等原料，在称量后要连同称量纸一起投 入水中，待原料被洗下后再将称量纸取出；对于马铃薯培养基，需要先将土豆切成均匀的小块，然后加水 煮至沸腾，并维

21、持 15min,用纱布过滤，取溶液部分进行培养基的配制）。2、溶解：将白瓷杯放在电磁炉上，用文火加热，不断搅拌，并缓慢加入琼脂，待各药品完全溶解后， 定容至所需体积。3、定容：用蒸储水补足至所需体积。4、调节pH:用精密pH试纸或酸度计进彳T测定，并用10%的NaOK 10%HCl溶液进行调节，调 pH时要尽可能的避免回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。5、过滤：液体培养基用滤纸过滤，固体培养基则可以用 4层纱布趁热过滤。但是供一般使用的培养基， 这步可以省略。图2-1分装示意图6、分装：分装三角瓶：将融化的培养基倒入三角瓶中，其装量以不超过三角瓶总容量的 3/5为宜。分装试管：将融化

22、的培养基加至漏斗上，分装时左手并排拿着数根 试管，右手控制弹簧荚开关（如图 2-1 ）,将培养基依次加入各试管。用于 制作斜面培养基时，装量不超过试管高度的1/5 ,分装时谨防培养基沾在管口上，从而造成污染。7、加塞，包扎，贴标签（标签上要注明培养基的名称、组别或个人 名字、日期等）。8、灭菌（常用高压蒸汽灭菌）。9、无菌检查：检查的一般方法是放在 37c培养箱中培养过夜， 如果没有染菌，则证明灭菌彻底，反之， 则需要重新灭菌。按照上述步骤，参照附录二的配方，配制牛肉膏蛋白月东培养基、查氏培养基、高氏I号培养基、马铃者/口乔9。（三）灭菌（高压蒸汽灭菌）：高压蒸汽灭菌锅一旦发生事故，后果非常严

23、重 ，所以要严格按照操作说 明进行每一步的操作，并要注意以下的注意事项：1、灭菌之前首先要检查灭菌锅的水是否加好；、灭菌锅内装的东西不可过满，否则会导致灭菌不彻底；、灭菌锅盖一定要拧紧，防止热蒸汽冲开锅盖而发生事故。4、灭菌过程中，要有专人看守，一旦发现故障，应立即关闭电源，并报告指导教师；5、灭菌完毕后，应等到压力降至零以后，方可打开锅盖。五、实验报告.为什么一般情况下，细菌易被碱性染料染色？.简述配制培养基的一般步骤。.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的 ？.简述高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。实验三 细菌的简单染色及形态观察一、实验目的学习微生物涂片、染色的基本技

24、术。掌握细菌的简单染色法。初步认识细菌的形态特征。二、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞非常小，又因为其含水量高（一般在80%90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，与周围背景没有明显的明暗差，所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算活菌外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察，但不能辨别其构造。染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的

25、亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。三、实验材料菌种 ：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。染色剂 ：吕氏碱性美蓝染液（ 或草酸铵结晶紫染液） 、石炭酸复红染液。仪器或其他用具 ：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水等。四、实验步骤1、涂片 ：取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水（ 或蒸馏水 ） 于载玻片中央，用接种环以无菌操作（图 3-1 ），分别从枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液 （或液体培养物）涂片，可用接

26、种环挑取12环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。2、干燥：室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。3、固定：如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。图 3-1 涂片、干燥和热固定。4、染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液12滴于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色12min,石炭酸复红（或草酸镂结晶紫）染色约1min。5、水洗：倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜

27、脱落。6、干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。7、镜检：涂片干后镜检。涂片必须彻底干燥后才能用油镜观察，否则可能导致菌体脱落。图3-1无菌操作示意图图解：(1)将菌种斜面放在左手中指和食指之间，大拇指揪住试管。并使斜面向上，以便观察。(2)右手转动棉塞，便于拔出。(3)右手拿接种针，使其直立于火焰中，将接种针的电热丝部分烧红。(4)用小指与手掌夹取棉塞。在拔棉塞时用力不宜过猛，以免将外界杂菌带入管内。还应该注意不要将 棉塞和已烧过的接种针碰到物体上。试管也应保持水平位置，并在火焰附近。(5)取出棉塞后，将管口均匀通过火焰。(6)将接种针伸入菌种管内

28、，先与斜面顶端的培养基接触，使其冷却，然后在斜面上挑取菌体。(7)将管口均匀通过火焰，立即塞上棉塞。(8)用过的接种针必须在火焰中灼烧后，才能放置它处，一是防止菌种污染环境，另外，还可以防止菌种间的交叉污染。五、实验报告绘制单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，标明视野，并注明其放大倍数和菌种类别。实验四细菌的革兰氏染色一、实验目的. 了解细菌的革兰氏染色法的原理。.掌握革兰氏染色法的主要步骤 二、实验原理图4-1革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁图反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的 重要性状。它是

29、1884年由丹麦医师Gram 创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅 能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌 区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为 革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈 红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌， 用G表示。细菌对于革兰氏染色的不同状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液(番红)的颜

30、色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant);脱色剂(decolorisingagent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用 于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘( iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色 的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一

31、种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成 G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、实验材料.菌种：枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。.染液：草酸俊结晶紫染液、卢戈氏碘液、95叱醇、番红液。.其他：显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。 四、实验步骤(见图 4-2 )1、涂片：将培养14-16小时的枯草芽抱杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2、染色(1)初染：

32、加草酸俊结晶紫一滴，约 1分钟，水洗。(2)媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1分钟，水洗。(3)脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30秒钟，立即用水冲净酒精。(4)复染:用番红液染色 1-2分钟，水洗。(5)镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌 的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。图4-2革兰氏染色的步骤(6)检测：试利用上述方法，检测金黄色葡萄球菌的革兰氏染色反应的颜色。注意事项：酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，

33、如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的培养时间过长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应，所以被检菌的菌龄一般最好在 18-24h之内。五、实验报告.绘出枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革

34、兰氏阴性菌？.如果涂片未经热固定，将会出现什么问题？.你的实验结果与课本中所述是否一致？如不一致，试分析原因。实验五 细菌的荚膜染色一、实验目的学习和掌握荚膜染色的方法，观察和了解细菌的荚膜形态。二、实验原理荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的分泌于细胞壁外的粘液状物质。其主要化学成分是水和多糖类物质。荚膜的折光率低、与染料的亲和力差，不易着色。通常采用负染色方法，即：使菌体和背景着色，而荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不用热固定或微热固定，以免荚膜皱缩变形。三、实验材料菌种：褐球固氮菌、肠膜状明串珠菌。试剂：墨汁、番红染色液、6%的葡萄糖液。3

35、其他：显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。四、实验步骤1、制片：在载玻片一端加一滴6%的葡萄糖液，取少许培养72 小时的褐球固氮菌或肠膜状明串珠菌与其充分混合，再滴一滴墨汁，混匀。左手执载玻片，右手拿另一光滑的载玻片（推片），将推片一端边缘置于菌液前方，然后稍向后拉，当接触菌液后，轻轻地向左右移动，使菌液沿着推片接触后缘散开，以 30 度角迅速而均匀地将菌液推向玻片另一端，使菌液涂成一薄膜。风干。2、染色：加番红染液或墨汁与标本上，30s 后，用细水流适当冲洗。3、干燥、镜检。五、实验报告1 绘图，注明各部分的名称与颜色，并注明放大倍数。实验六 细菌的芽孢染

36、色法一、实验目的学习和掌握细菌的芽孢染色法，观察和了解细菌的芽孢形态。二、实验原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低、不易着色，若用一般染色法，只能使菌体着色，而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色，而一旦染上后，又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使得菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。三、实验材料菌种：枯草芽孢杆菌。染料：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。其他：显微镜、载玻片、试管夹

37、、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯等四、方法与步骤1、将培养 24 小时左右的枯草芽孢杆菌做涂片、干燥、固定。2、将孔雀绿染色液滴加3-5 滴于已固定的涂片上。3、用试管夹夹住载玻片在火焰上加热，使染料冒蒸汽但不沸腾，切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约 5-7 分钟。4、倾去染色液，等玻片冷却后，水洗至孔雀绿不再退色为止。5、用番红染色液复染1-3 分钟。6、水洗吸干。7、镜检。五、实验报告： 绘图，注明各部分的名称与颜色，并注明放大倍数。实验七 放线菌形态和菌落特征观察一、实验目的学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；初步了解放线菌的形态及其菌落特征。二

38、、实验原理放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏染色为阳性的原核微生物，它的菌丝可分为基内菌丝（ 营养菌丝 ） 、气生菌丝和孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横隔分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。放线菌的菌落早期绒状，同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。三、实验材料菌种：细黄链霉菌、青色链霉菌、弗氏链霉菌。各菌种早期和晚期的培养平板。.培养基：灭菌的高氏I号琼脂培养基。3染料：

39、石炭酸复红染液、吕氏美兰染液。4其他：培养皿，玻璃纸，盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，显微镜等。四、操作步骤（一）放线菌形态的观察.托片法：在高氏I号琼脂平板上划线接种，以无菌操作将灭菌的盖玻片以45o打入琼脂内，倒置28c培养35d后直接镜检，观察气生菌丝和抱子丝的形态。.玻璃纸法：将已灭菌的玻璃纸片铺在培养基平板上，压平玻璃纸后接种，倒置28c培养35d 后直接镜检。印片法：接种培养后，将平板上的菌苔连同培养基切下，菌面朝上放在载玻片上。另取一载玻片盖在菌苔上，按压（印片用力要轻） 、火焰固定后再用石炭酸复红染色液染色lmin ，镜检。（二）放线菌菌落特征的观察分别观察

40、早期和后期的菌落特征。四、注意事项1 培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。2玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，3不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置。五、实验报告1. 将观察结果绘图，并注明各部位的名称。2试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。3镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？4分别描述观察到的早期的和后期菌落形态。实验八 霉菌的形态和菌落特征观察一、目的要求掌握霉菌的标本制作方法。观察四类常见霉菌的基本形态和菌落特征。二、实验原理霉菌的营养体是分枝的丝状

41、体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形；具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察，此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上

42、，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。观察根霉时，注意观察其菌丝，无横隔，假根，孢子囊柄、囊轴、囊托、孢囊孢子及厚垣孢子。观察毛霉时，注意观察其菌丝，无横隔，孢子囊柄、囊轴、孢囊孢子及厚垣孢子。观察曲霉时，注意观察其菌丝，有横隔，足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗，分生孢子的着生情况。观察青霉时，注意观察其菌丝，有横隔，分生孢子梗，帚状枝、分生孢子的着生情况。三、实验材料1.菌种：曲霉、青霉、根霉和毛霉培养25d的马铃薯琼脂平板培养物和玻璃纸培养

43、物。2培养基：马铃薯葡萄糖培养基或查氏培养基。染料：乳酸石炭酸棉蓝染色液。其他：无菌吸管，培养皿，载玻片， U 形玻棒、盖玻片，玻璃棒，接种环，滤纸、解剖针，解剖刀，镊子， 20 的甘油以及显微镜等。四、操作步骤一般观察法于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。载玻片观察法将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U 形玻棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套(根据需要而定)如此装置的

44、培养皿叠起，包扎好，用1 05kg/cm2 ， 121 3灭菌 20 分钟或干热灭菌，备用。将 6-7ml 灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm 的灭菌培养皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0. 5-1cm2的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针，取(肉眼方能看见的)一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的 边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。在培养皿的滤纸上，加无菌的20甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加。将培养皿置28培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。3 玻璃纸透析培养观察法向霉菌斜面试管中加

45、入 5ml 无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。用 1ml 无菌吸管吸取0 2ml 孢子悬液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。置 28温室培养48 小时后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。五、实验报告绘出所观察到的各种霉菌的形态图，注明各种结构的名称。你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？你是否成功的完成了第2 和 3 的实验？若没完成，试分析原因。实验九 酵母菌的形态和菌落特征观察及死活鉴定、实验目的观察酵母菌的形态和菌落特征、出芽生殖方式

46、，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。学习鉴别死活细胞的实验方法。二、实验原理酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。美蓝是一种毒性很低的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法

47、可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。酵母菌的菌落与细菌有一定相似，湿润、光滑、有一定的透明度，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘，中央部位的颜色都很均一等特点。三、实验材料菌种：酿酒酵母。染料： 0.05 和 O.1 吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。其他：显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。四、实验步骤（一）美蓝染色液水浸片观察、在载玻片中央加一滴0 1吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。2、用镊子夹盖

48、玻片一块，小心地盖在液滴上。用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。3 、将制好的水浸片放置3 分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。4、染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。5 、用0 05吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。（二）水一碘液水浸片观察按照上述方法进行操作。五、实验报告绘图说明你所观察到的酵母菌的形态和菌落特征。吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。美蓝染色液和水一碘液对酵母菌的活性影响是否

49、一致，为什么？4 你认为在显微镜下，细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的主要区别是什么？实验十 微生物细胞大小测定与显微直接计数法一、实验目的了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。二、实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（ 此处正好与物镜放大的中间像重叠） 来测量经显微

50、镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm等分为100格，每格长10 m （即0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一

51、定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4 条槽而构成3 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为 16个中方格（中方

52、格用三线隔开），而每个中方格又分成25 个小方格；另一种是一个计数区分成25 个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16 个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由 400 个小方格组成。计数区边长为1mm则计数区的面积为1 mm2,每个小方格的面积为 1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区 的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为 1/4000mm3o每个中方格的体积为1/250 mm3 （25 个中方格 ）或 1/160 mm3 （16个中方格）。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每

53、毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。33已知： 1mL=1cm= 1000mm所以：1mL体积应含有小方格数为1000mmy1/4000mm3=4X 106个小方格，即系数=4X 106。1mL体积应含有中方格数为：1000m吊1/250mm3=2.5 X 105 或 1000mmM/160mm3=1.6 X105因此：1ml菌悬液中含有细胞数=每个小（中）格中细胞平均数x相应的系数x菌液稀释倍数。三、实验材料菌种：酿酒酵母、枯草杆菌染色标本片。仪器和用品：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、移液器、香柏油、二甲苯、盖玻片等。四、实验步骤微生物大小的测定（ 1）目镜测微尺的校正

54、把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0 ”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10科3所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为10 dm则目镜测微尺上每小格长度为 =5 X 10m/5 = 10m用同法分别校正在高倍

55、镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。（ 2）微生物细胞大小的测定1）将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2 ）2）取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。3）移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般

56、测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10 20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。微生物的显微计数（ 1）稀释样品：加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。（ 2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。（ 3）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度

57、的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。(4)静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。 由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。(5)计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格(即100小格)的菌数。如果是 25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央l个中方格的菌数(即80个小格)。如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少得主庆2 o(6)对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数23次(每次数

58、值不应相差过大，否则应重新操作)，求出每一个小格中细胞平均数(ND ,按公式计算出每 ml(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。(7)测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。五、实验报告1.目镜测微尺校正结果物镜目尺格数台尺格数目尺校正值(mm10X40 X100X酵母菌大小测定记录(格)结果计算长科m=平均格数x校正值宽核01=平均格数x校正值大小表小：宽 mX长m 2.计数次数母个中方格国数稀释倍数试管斜面中的 总菌数平均值12345A次第二次1实验十一平板计数法和光电比浊计数法、实验目的了解稀释平板计数

59、的原理，掌握涂抹平板法和倾注平板法。了解光电比浊计数法的原理，学习掌握光电比浊计数法的操作方法。二、实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上, 经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以 ，长成的一个单菌落也可来自样品中的 23或更多个细胞，因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（colony-forming

60、 units,cfu） ，而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较复杂，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响， 但是， 由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息， 所以被广泛用于生物制品检验（ 如活菌制剂） ，以及食品，饮料和水（ 包括水源水） 等的含菌指数或污染程度的检测。当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内 , 微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此, 可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，做出光密度菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，