食品微生物8微生物分离、纯化与保藏技术课件

1、8 微生物分离、纯化与保藏技术8.1 微生物菌种的分离纯化模块二：微生物检验基础技能训练食品微生物（1）学习并掌握微生物分离纯化的原理和分离纯化的技术。（2）学习从样品中分离、纯化出所需菌株。第一节 微生物菌种的分离纯化一、实训目的：微生物分离、纯化与保藏技术二、实训原理分离纯化技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离纯化：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯种（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。微生物菌种的分离纯化三、实验材料样品：细菌：大肠杆

2、菌，金黄色葡萄球菌放线菌：细黄链霉素酵母菌：啤酒酵母霉菌;黑曲霉培养基：普通琼脂斜面和平板，营养肉汤仪器与用具：接种环、接种针、试管架、酒精灯、记号笔、标签、火柴、灭菌培养皿、无菌水、菌种等。微生物菌种的分离纯化取样制备稀释液分离四、实训方法与步骤0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml微生物菌种的分离纯化1、倾注平板法分离：注意培养基温度，混合均匀先加菌微生物菌种的分离纯化2、涂布分离法分离：微生物菌种的分离纯化1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 1) 倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。 2）划线方法3、平板划线法微生物菌

3、种的分离纯化利用选择培养基创造只让所需微生物生长的条件，所需微生物有效地与其他微生物竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如分离专性寄生菌，须把样品接种到相应敏感宿主细胞群中，使其大量生长。多次重复移种便可得到纯的寄生菌。 4、富集分离法微生物菌种的分离纯化利用装原培养基的试管作培养容器，在沸水浴中加热数分钟，逐出培养基中的溶解氧。快速冷却，并进行接种。加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。或在接种后，用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上

4、试管口密封。为了更有效地分离某些厌氧菌，可把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。、厌氧法微生物菌种的分离纯化五、实训结果第一节 微生物菌种的分离纯化（一）菌落观察菌落大小形状表面边缘湿润度透明度色素菌名菌落1菌落2菌落3菌落4菌落51、微生物菌落特征 1）肉眼观察 2）细致区分还要用显微镜，观察细菌形态。菌落湿润，正反面颜色一致 干燥，正反、中央与边缘 小、扁平或隆起 大、扁平或隆起 小、而致密 大、疏松、颜色不一致 细菌 酵母菌 霉菌 放线菌 微生物常规鉴定、筛选2、微生物生理生化反应 第二节 微生物常规鉴定、筛选1）营养要求：采用选择培养基2）酶：产酶种

5、类和反应特性3）代谢产物：种类，产量，显色反应等（二）微生物常规鉴定思考与讨论 微生物菌种的分离纯化1如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？2. 接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？广东食品药品职业学院食品科学系8 微生物分离、纯化与保藏技术8.2 微生物菌种的保藏模块二：微生物检验基础技能训练菌种的保藏与菌种管理菌种退化：菌种在自发突变的影响下，引起某些优良特性降低或丧失的现象。生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；菌种衰退原因：基因突变一、菌种退化菌种保藏与复壮工作:

6、为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退菌种退化：菌种在自发突变的影响下，引起某些优良特性降低或丧失的现象。菌种衰退原因：基因突变一、菌种退化菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； 菌种保藏与复壮工作:为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退菌种的保藏与菌种管理二、菌种的复壮(一)菌种的提纯(二)通过寄主体进行复壮 (三)淘汰已衰退的个体 菌种的保藏与菌种管理(一)菌种的提纯 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。菌种提纯：只要求达到菌落纯化的水平

7、，通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，适用于退化不太严重的情况。要求达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。菌种的保藏与菌种管理(二)通过寄主体进行复壮 对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及衰退现象。可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。 菌种的保藏与菌种管理(三)淘汰已衰退的个体通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良

8、菌种来。菌种的保藏与菌种管理三、菌种保藏菌种保藏：是使微生物种子经过长时间保存后，尽可能保持其原来性状和活力不变，不死亡、不污染（一）菌种保藏的目的保持其原有性状和活力的稳定；确保菌种不死亡、不变异、不被污染；菌种的保藏与菌种管理保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处于受抑制的休眠状态。（二）菌种保藏依据：菌种的保藏与菌种管理(三)菌种保藏方法：斜面低温保藏法 砂土管保藏法石蜡油封藏法冷冻真空干燥保藏法滤纸保藏法甘油悬液保藏法液氮超低温保

9、存菌种的保藏与菌种管理1.斜面低温保藏法常用保藏法菌种接种斜面培养基生长健壮的菌种4左右的冰箱中保藏定期移植至新培养基继续保藏适用菌种的短期保藏一般可保存16个月左右。特点(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理简便易行容易推广存活率高；优点:保藏期短传代次数多易发生变异易被污染缺点:一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理沙土管的准备：河(海)沙过24目筛，10盐酸浸泡24h，去盐酸，水冲洗至pH中性，去水烘干或晒干。取菜果园土粉碎过筛，烘干。沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直径为10mm的小试管，高约1cm(约2g)，塞棉塞121

10、湿热灭菌1h，也可1702h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。2、沙土管保藏法(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理菌种斜面产孢孢子悬浮液（106/ml ）加入沙土管（ 0.30.5ml/管）减压干燥密封4低温保藏沙土管保藏流程：(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理砂土管保藏法的特点包藏初期，菌死亡率高，后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好。(三)菌种保藏方法：适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。菌种的保藏与菌种管理砂土管保藏法的优点具低温、干燥、隔氧和少营养物等条件保藏期较长、效果较好。某些抗生素

11、产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。微生物移接方便，经济简便。(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理3、矿油保藏法（石蜡油低温保藏法） 长好的斜面菌覆盖灭菌液体石蜡 菌体与空气隔绝 直立保藏于-44低温或室温注意事项：斜面培养菌种，斜面不宜过长；纯净优质石蜡油，置三角烧瓶经121高压蒸汽灭菌12h，放烘箱中(160左右)干热处理，除灭菌时渗入水分，待石蜡油变清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与

12、菌种管理矿油保藏法特点：适用于各大类不产孢子的微生物菌种的中期保藏不适用于能分解烃类的菌种的保藏。主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存12年左右。(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理4、真空冷冻干燥法 低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥、封装，隔绝空气，微生物的生长和酶活动停止。达到长期保藏的目(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理真空冷冻干燥法优点：具低温、干燥、除氧主要因素，适用于除丝状真菌的菌丝体外的其它各类微生物。菌种存活时间长、效果好，一般可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。体积小、不易污染、便于运输，为最广泛的菌种保藏法。(三)菌种保藏方法：冻干保藏的效果

13、因微生物种类而异，一般是细菌放线菌真菌藻类，而菌丝体不宜用此法保存。菌种的保藏与菌种管理冷冻真空干燥操作流程安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签灭菌预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度保藏无菌血清或脱脂牛乳-40冰箱速冻结2060min1%3%5、滤纸保藏法 方法：3#滤纸剪成5mm50mm小条，放入干燥培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将灭菌滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏将要保藏微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理不同的保存方法都有一定的不足，因此，尽量同时用多种方法保存(三)菌种保藏方法：菌种的保藏与菌种管理（四）微生物的保藏机构中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)中国典型培养物保藏中心(CCTCC)美国典型菌种保藏中心(ATCC)荷兰霉菌中心保藏所(CBS)英国国