血红蛋白的提取与分离课件

1、 课题3 血红蛋白的提取与分离专题五 DNA和蛋白质技术（第二课时）1凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向BBB知识回顾4、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 （ ）A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质

2、量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较A知识回顾 电泳 前处理粗分离细分离 生物组织 无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析蛋白质分离纯化的一般步骤（1）洗涤红 细 胞 （2）释放血红蛋白 （3）分离血红蛋白 （4）透析血红蛋白1、样品 处理3、纯化4、纯度鉴定2、粗分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶色谱法进行纯化实验操作 知识回顾1. 血液有哪些成分？血液血浆水 分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细 胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90）两个肽链两个一肽链四个亚铁红素基团2. 你认为鸟

3、类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水缓慢搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色实验操作 （一）样品处理采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次500 rmin离心2min1. 洗涤红细胞采集得到血液实验操作 （一）样品处理初次离心后的结果3次洗涤后的结果实验操作 （一）样品处理（1）柠檬酸钠的作用是 ：_（2）低速短时离心： _（3）洗红细胞的目的是：_（4）缓慢搅拌的目的是： _实验操作 （一）样品处理防止血液凝固 去除杂蛋白防止白细胞和淋巴细胞沉淀防止红细胞破裂抗凝剂都要迅速、轻柔、反复

4、混合均匀 1. 洗涤红细胞操作提示2.血红蛋白的释放实验操作 （一）样品处理红细胞烧杯红细胞加蒸馏水到原血液的体积红细胞40%体积甲苯磁力搅拌器搅拌10min红细胞破裂，释放出血红蛋白磁力搅拌器搅拌器转子实验操作 （一）样品处理搅拌器正在工作实验操作 （一）样品处理 （1）蒸馏水的作用是_。（2）加入甲苯的作用是_。（3）充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂实验操作 （一）样品处理2.血红蛋白的释放操作提示3.分离血红蛋白溶液滤纸过滤脂类物质细胞破碎物沉淀中速长时离心离心管烧杯有机溶剂血红蛋白2000 rmin离心10min红细胞混合液实验操作 （一）样品

5、处理静置片刻第1层（最上层）： （ ）甲苯层第2层： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体第3层： （ ）的水溶液层 （ ）的液体 第4层： 其它杂质（ ）的沉淀层无色透明脂溶性物质白 血红蛋白红色透明暗红色舜狙留祥潞晓划澜凭啦灵咏陵到卤刘殷拎淤抉腰酵侍谗瓢叮犀戴鸡尺蜗技课题3血红蛋白的提取与分离自制课题3血红蛋白的提取与分离自制实验操作 （一）样品处理提示：实验操作 （一）样品处理1、红细胞混合液含有： _ 2、滤纸的作用： _3、分液漏斗的作用是：_细胞破碎物、脂质、甲苯等过滤除去脂质和细胞破碎物分离血红蛋白和有机溶剂3.分离血红蛋白溶液实验操作 （二）粗分离透析目的：除去样品中分子量较小的

6、杂质。说明：透析膜是半透膜，蛋白质是大分子，它不能透过透析膜，而小分子物质可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液。4、透析透析袋1ml血红蛋白溶液磷酸缓冲液300-500ml20mmol/L， pH为7.0透析12小时液实验操作 （二）粗分离透析期间，多次置换缓冲溶液。实验操作 （二）粗分离透析实验操作 （二）粗分离透析4、透析1、缓冲溶液的作用：模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。2、维持小分子扩散驱动力和透析速率：膜两侧溶液趋于平衡时，需要置换缓冲液；缓冲液和样品的最佳体积比为500：1。3、装样时，不可装太满，须留出一半空隙，适当排出空气，以防溶剂渗

7、入造成样品体积增加而引起透析袋涨破。提示：实验操作 （二）粗分离透析4、透析（1）洗涤红 细 胞 （2）释放血红蛋白 （3）分离血红蛋白 （4）透析血红蛋白1、样品 处理3、纯化4、纯度鉴定2、粗分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶色谱法进行纯化纯化凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5193.样品的加入和洗脱实验操作 纯化凝胶色谱法1、凝胶色谱柱的制作：实验操作 纯化凝胶色谱法打孔挖穴安管覆网纱包插管注意：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。实验操作 纯化凝胶色谱法2、凝胶色谱柱的装填凝胶的选择： 交联

8、葡聚糖凝胶G-75“G“凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 75凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。实验操作 纯化凝胶色谱法2、凝胶色谱柱的装填步骤操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀凝胶颗粒洗脱液沸水浴装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 2.凝胶色谱柱的装填50cm高固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡沸水浴加热 紧密 不得有气泡磷酸缓冲液(pH为7.0）实验操作 纯化凝胶色谱法注意：凝胶装填时尽量紧密，均匀，以降低凝胶颗粒之间的空隙； 装填凝胶柱时不能有气泡存在。

9、（气泡和空隙会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果）装配好的凝胶柱实验操作 纯化凝胶色谱法实验操作 纯化凝胶色谱法3.样品的加入和洗脱调液面加样再调液面 洗脱 收集缓冲液凝胶注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。样品加入与洗脱正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。实验操作 纯化凝胶色谱法实验操作 纯化凝胶色谱法实验操作 纯化凝胶色谱法 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）实验操作 纯化凝胶色谱法收集得到的纯

10、化后的蛋白实验操作 纯化凝胶色谱法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。实验操作 纯化凝胶色谱法 在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有SDS-蛋白质复合物都向着阳极迁移。大的蛋白质会遇到更多的阻力，因此它们迁移的速度比小的蛋白质慢。 凝胶通过染色（常用的考马斯亮蓝染料）出现不同的蛋白带。实验操作 纯化凝胶色谱法血红蛋白经过SDS电泳后的效果两条肽链两种肽链实验操作 纯化凝胶色谱法 观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细

11、胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？结果分析与评价 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的

12、红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？结果分析与评价1、不要做刺猬，能不与人结仇就不与人结仇，谁也不跟谁一辈子，有些事情没必要记在心上。2、相遇总是猝不及防，而离别多是蓄谋已久，总有一些人会慢慢淡出你的生活，你要学会接受而不是怀念。3、其实每个人都很清楚自己想要什么，但并不是谁都有勇气表达出来。渐渐才知道，心口如一，是一种何等的强大!4、有些路看起来很近，可是走下去却很远的，缺少耐心的人永远走不到头。人生，一半是现

13、实，一半是梦想。5、你心里最崇拜谁，不必变成那个人，而是用那个人的精神和方法，去变成你自己。6、过去的事情就让它过去，一定要放下。学会狠心，学会独立，学会微笑，学会丢弃不值得的感情。7、成功不是让周围的人都羡慕你，称赞你，而是让周围的人都需要你，离不开你。8、生活本来很不易，不必事事渴求别人的理解和认同，静静的过自己的生活。心若不动，风又奈何。你若不伤，岁月无恙。9、命运要你成长的时候，总会安排一些让你不顺心的人或事刺激你。10、你迷茫的原因往往只有一个，那就是在本该拼命去努力的年纪，想得太多，做得太少。11、有一些人的出现，就是来给我们开眼的。所以，你一定要禁得起假话，受得住敷衍，忍得住欺骗，忘得了承诺，放得下一切。12、不要像个落难者，告诉别人你的不幸。逢人只说三分话，不可全抛一片心。13、人生的路，靠的是自己一步步去走，真正能保护你的，是你自己的选择。而真正能伤害你的，也是一样，自己的选择。14、不要那么敏感，也不要那么心软，太敏感和太心软的人，肯定过得不快乐，别人随便的一句话，你都要胡思乱想一整天。15、不要轻易去依赖一个人，它会成为你的习惯，当分别来临，你失去的不是某个人，而是你精神的支柱;无论何时何地，都要学会独立行走，它会让你走得更坦然些。16、在不违背原则的情况下，对别人要宽容，能帮就帮，千万不要把人逼绝了，给人留条后路，懂得