人教版(新教材)高中生物选择性必修3第3章 基因工程素养进阶(四)

1、人教版(新教材)高中生物选择性必修3 素养进阶（四）科学探究利用双酶分别同时切割法构建基因表达载体构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此外，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。心动了启动丁:氮卡靑障枣航性基阖氮苦吉霉寿吭性堪1窃阵迪质粒I栽轲鮒呼基門丄Ilut/tHIrtfcIIn.i-jar-iII山连按ij-iiiiiII的；丛1対所fE的刖A甘子由图示可知，质粒经BamHI和

2、EcoRI切割后，分别形成黏性末端1与2,目的基因所在的DNA分子经BamHI和EcoRI切割后，分别形成黏性末端3与4。请结合学习过的“单酶切法”和“双酶分别切割法”，据图回答下列问题：（1）已知BamHI和EcoRI识别的核苷酸序列和切割位点分别为：丽mHfEmRI一口GATCCGAAITCCCTAGGCTFAAG则DNA分子经BamHI和EcoRI切割后所形成的末端是否互补（相同）？提示：不互补（不相同）。（2）黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？提示：均不能，因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补（不相同）。这说明“双酶同时

3、切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。（3）黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？提示：均不能。这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。典型例题1下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。相关说法错误的是()HindHFSf/lrl1-GAATTC-AAGCTTCCCGGG-CTTAAGTTCGAAGGGCCC1tt乩5卜11=GGATCCCCTAGG图1个图2所示的质粒分子经SmaI切割后，含有4个游离的磷酸基团用图2所示的质粒和图3所示的目的基因构建重组质粒，不能使用SmaI切割

4、图3中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcoRI为了获取重组质粒，最好用BamHI和HindIII同时切割质粒和外源DNA解析图2所示质粒分子经SmaI切割后形成2个平末端，根据DNA分子的两条链反向平行的特点可知，切割后应含有2个游离的磷酸基团，A错误；用SmaI切割会破坏目的基因和质粒中的标记基因，B正确；用EcoRI处理的目的基因由于两端含有相同的黏性末端而可能发生自身环化，用两种限制酶同时切割质粒和外源DNA即可解决这一问题，所以可以用BamHI和HindI同时处理，C、D正确。答案A变式训练1(2020.福建省福州第一中学高二期末)限制酶可辨识并切割DN

5、A分子上特定的核苷酸碱基序列。下图依次为四种限制酶BamHI、EcoRI、HindIII以及BgtII的切割位点和辨识序列。为防止酶切后含目的基因的DNA片段自身连接成环状，下列不能同时切割目的基因的是()GGAICC-CCTAGG-GAATTC-CTTAAG-HtndIIII-AAGCTT-TTCGAA-B歆II4-AGATCT-TCTAGA-I阳IEJU的i基因IHinJHIEcoRI和HindIIIB.EcoRI和BgtIIC.BamHI和HindIIID.BamHI和BgtII解析限制酶所识别的是特定的碱基序列，并在特定部位进行切割，不同的限制酶识别不同的核苷酸序列并识别不同的切点。由

6、图示可知BamHI和BgtI都可切出序列一GATC的黏性末端，可以互补配对，因此用BamHI和BgtII同时切割目的基因不能防止酶切后含目的基因的DNA片段自身连成环状。答案D科学探究利用双标记基因法筛选导入重组载体的受体细胞构建基因表达载体是基因工程技术的核心步骤。下图表示利用两种能产生不同黏性末端的限制酶EcoRI和Hindi,分别同时切割质粒和目的基因所在的DNA分子，构建基因表达载体的过程，请据图回答问题。f氨抗性基lib普迪质粒（找條）I肚局111IH的基因I車细航粒常种限制暉创剤已氏违雀酿连按在用DNA连接酶连接后，会不会出现目的基因或质粒的自身环化？为什么？提示：不会，因为目的基

7、因两端的黏性末端不互补（相同），质粒上的两个黏性末端也不互补（相同）。（2）在用DNA连接酶连接后形成的重组质粒上面有哪些标记基因？普通质粒呢？提示重组质粒上只有Ampr一个标记基因，普通质粒上有Ampr和Tetr两个标记基因。人教版（新教材）高中生物选择性必修3人教版(新教材)高中生物选择性必修3 （3）将目的基因导入受体细胞的成功率并非100%，经过这一步操作之后得到的大肠杆菌，除了没有被成功导入质粒的类型外，还有哪些类型？提示：还有成功导入普通质粒的大肠杆菌和成功导入重组质粒的大肠杆菌两种类型。（4）假设普通的受体细胞大肠杆菌对Amp（氨苄青霉素）和Tet（四环素）都敏感，在含有Amp或

8、Tet的培养基上都不能生长。则导入普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌在上述两种培养基上的生长情况分别是什么？提示：导入普通质粒的大肠杆菌在两种培养基上都可生长；导入重组质粒的大肠杆菌在含有Amp的培养基上可以生长，在含有Tet的培养基上不能生长。（5）科学家发明了影印接种技术，从普通大肠杆菌、导入普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌中筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下图表示影印接种技术的大致过程和结果。含有人泪p的选样培弄基舍TTtz的选样培养耳沾呻厂包有灭她站的圆弋常-木晟制亦的”印章一影印接种过程示意图在含有Amp的选择培养基上生长的大肠杆菌菌落,是由普通大肠杆菌或导入普通质粒

9、的大肠杆菌繁殖形成的，还是由导入重组质粒的大肠杆菌繁殖形成的？为什么？提示：有的是由导入普通质粒的大肠杆菌繁殖形成的，有的是由导入重组质粒的大肠杆菌繁殖形成的，因为这两种大肠杆菌都含有Ampr,都对Amp有抗性；不可能是由普通大肠杆菌繁殖形成的，因其没有Ampr,对Amp没有抗性。影印接种到含有Tet的选择培养基上后，在该培养基上生长的菌落，是由哪种大肠杆菌繁殖形成的？提示：导入普通质粒的大肠杆菌。结合两种选择培养基的培养结果，你认为在含有Amp的选择培养基中，哪些菌落是由导入重组质粒的大肠杆菌形成的？（用菌落编号回答）提示：1、4、6、8、11。典型例题2(2019江苏卷33)图1是某基因工

10、程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：图1GATlATCEcoRV酶切位点为，EcoRV酶切出来的线性载体P1为CTAfTAG末端。用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在酶作用下，形成重组质粒P3。为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“”代表生长，“”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是(填表中字

11、母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是、。菌落类型平板类型ABC无抗生素+氨苄青霉素+四环素+氨苄青霉素+四环素+(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是图2解析（l）EcoRV酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。（2）DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则

12、，处理后的载体质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。（3）由于四环素抗性基因中含有EcoRV酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说B菌落中导入的是重组质粒;C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。（4）由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可

13、能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50bp+300bp+100bp=450bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300bp+100bp=400bp的片段。答案（1）平（2）胸腺嘧啶（T）DNA连接（3）BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒（4）乙丙目的基因反向连接变式训练2（2020.北京

14、四中高二期末）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨

15、苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是；并且和的细胞也是不能区分的，其原因是。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有的固体培养基。解析(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。(2)依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均

16、不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基上不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。答案(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒）二者均含

17、有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素进阶训练（四）1.（2020.汉川市第二中学高二期末）获得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线如下图。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是()农肚|/报告基因（含有内含子）J-DNA抗性基阖Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点酶切后,G基因形成的两个黏性末端序列不相同酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同B.C.D.解析为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，则质粒内每种限制酶只有一个切割位点，正确；含目的基因DNA内每种限制酶也只有一个切割位点，目

18、的基因内不能有限制酶切割位点，错误；为防止酶切产物自身环化，则酶切后的两个黏性末端序列不同，正确、错误。答案A2.（2020.莱芜市高二联考）某实验小组利用下图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是（）PBR322氧卡百奇索抗性甚岡抗性慕因JrII的旅因图中的质粒用酶A切割后，会产生8个游离的磷酸基团在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长若用酶B和酶C切割，可以避免质粒的自身环化解析质粒中含有2个酶A的酶切位点，所以切割后会产生4个游离的磷酸基团，A错误；如果用酶A和酶C同时切割质

19、粒，会破坏质粒的标记基因，B错误；根据B项分析，需要用酶B和酶C切割质粒和目的基因，导致四环素抗性基因被破坏，所以不能在含四环素的培养基中生长，C错误；若用酶B和酶C切割，产生不同的黏性末端，可避免质粒自身环化，D正确。答案D3.(2020.衡水二中高二联考)下图表示某质粒上的氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr),P点为目的基因插入位点，则成功导入重组质粒的受体细胞不能在含氨苄青霉素培养基上生存，能在含四环素培养基上生存既不能在含氨苄青霉素培养基上生存，也不能在含四环素培养基上生存解析据图可知目的基因插入四环素抗性基因(Tetr)中，导致该基因被破坏，氨苄青霉素抗性基因(

20、Ampr)保持完整结构，因此成功导入重组质粒的受体细胞，能在含氨苄青霉素培养基上生存，不能在含四环素培养基上生存。答案B4.(2020.云南民族大学附属中学高二月考)下图表示基因工程中构建生产人乳铁蛋白的重组载体。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因BamHI、HindIII、SmaI直线所示为三种限制酶的酶切位点。图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用几种限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因？筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含哪种抗生素的培养基上进行？()A.1种四环素C.1种氨苄青霉素B.2种氨苄青霉素A乳铁蛋I基因D.2种四环素解析外源DNA分子上含有限制酶Bam

21、Hl、HindIII、SmaI的切割位点，其中限制酶SmaI的切割位点位于目的基因上，所以获取目的基因和构建基因表达载体时，应用HindIII和BamHI2种限制酶。用限制酶HindIII和BamHI切割质粒后，会破坏质粒上的四环素抗性基因tetR，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因ampR,因此筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含氨苄青霉素的培养基上进行。因此，B正确，A、C、D错误。答案B5.（2020.北京高二期末）下图为获得抗除草剂转基因玉米A的技术路线，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织

22、可能在含除草剂的培养基中生长。相关叙述错误的是（）采用PCR扩增目的基因时，设计的引物间要避免形成氢键为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种不同的限制酶检测是否转化成功，需要依次利用抗生素抗性基因和报告基因利用T-DNA可以将目的基因插入到农杆菌的染色体DNA上解析采用PCR扩增目的基因时，设计的引物应与模板链结合，所以引物间不能形成氢键，A正确；为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种不同的限制酶，产生不同的黏性末端，以防止酶切产物自身环化，B正确；利用抗生素抗性基因可检测基因表达载体是否导入农杆菌，由于转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养

23、基中生长，且含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色，所以再通过报告基因可检测目的基因是否转化成功，C正确；农杆菌属于原核生物，无染色体，D错误。答案D6.（2019辽宁鞍山一中高二期中）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素人教版（新教材）高中生物选择性必修3人教版（新教材）高中生物选择性必修3 抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，之后受体细胞的类型（对两

24、种抗生素表现出抗性r或敏感性s）不包含（）B.Ampr、TetsA.Ampr、TetrC.Amps、TetrD.Amps、Tets解析大肠杆菌中含有质粒载体的，有两种抗性，即Ampr、Tetr，A不符合题意；含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌，有氨苄青霉素抗性，但没有四环素抗性，即Ampr、Tets，B不符合题意；大肠杆菌中，不存在有四环素抗性、没有氨苄青霉素抗性的类型，C符合题意；含有环状目的基因的大肠杆菌，没有抗性，即Amps、Tets,D不符合题意。答案C7.（2020.河南高二期末）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1）,拟将其与质粒（图2）重组再借助农杆

25、菌导入菊花中。请回答相关问题：田2终|一M子抗性基1対、吳【I：子（1）研究者从其他植物中克隆出花色基因C时米用了PCR技术扩增，扩增过程需要花色基因C、引物之外，还需要、。（2）为防止目的基因的自身环化和任意连接，有同学认为可以用EcoRI和BamHI两种酶切割含C基因的DNA片段和图中质粒，有同学认为不妥，理由是（3）最后需要将重组质粒导入菊花细胞研究者米用了农杆菌转化法，这是利用了农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）的特性：。若导入的是菊花体细胞，还需要通过才能得到菊花植株。解析（1）研究者从其他植物中克隆出花色基因C时采用了PCR技术扩增，扩增过程除需要花色基因C、引物之

26、外，还需要四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）。（2）为防止目的基因的自身环化和任意连接，有同学认为可以用EcoRI和BamHI两种酶切割含C基因的DNA片段和图中质粒，有同学认为不妥，理由是花色基因C两侧没有BamHI的识别序列，不能被BamHI酶切，质粒被EcoRI和BamHI两种酶切割后不能使目的基因连接在启动子和终止子之间。（3）最后需要将重组质粒导入菊花细胞，研究者采用了农杆菌转化法，这是利用了农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）的特性：可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。若导入的是菊花体细胞，还需要通过植物组织培养才能得到菊花植

27、株。答案（1）四种脱氧核苷酸TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）（2）花色基因C两侧没有BamHI的识别序列，不能被BamHI酶切，质粒被EcoRI和BamHI两种酶切割后不能使目的基因连接在启动子和终止子之间（3）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上植物组织培养8.（2020.黑龙江哈九中高二期末）由牛结核分枝杆菌引起的结核病是一种人畜共患病。西北农科大成功培育出了抗结核病的转基因牛。研究中使用的spllO基因来自小鼠，该基因的表达产物能够抑制牛结核分枝杆菌的增殖。经设计，sp110基因只在转基因奶牛的巨噬细胞中表达，其牛奶中不含转基因成分。（1）为防止酶切产物自身环化

28、，构建表达载体时可选用2种限制酶，酶切后，spllO基因形成的两个黏性末端序列（填“相同”或“不相同”）。（2）该转基因克隆牛在核移植过程中选取的卵母细胞需要培养到期。将转基因的细胞注入去核卵母细胞后，需要用方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。克隆出的牛犊与供体奶牛遗传物质相同，但也不是l00%的复制，原因可能是(至少答出两点)。(3)培育过程中为提高胚胎的利用率，可采用胚胎分割移植技术对囊胚的进行均等分割，为了使胚胎移植能成功，需要对代孕奶牛进行处理，使之与供体的生理状况保持相同。解析(1)如果用一种限制酶来切割目的基因两端和质粒时，目的基因两端会出现相同的末端，这样在构建基因表达

29、载体时，会出现3种情况：目的基因目的基因、目的基因载体、载体载体，这样会出现自身环化现象，因此为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，酶切后，spllO基因形成的两个黏性末端序列不相同。(2)通常选取处在MII期的去核卵母细胞作为受体细胞；通过物理或化学方法激活重组细胞，使其完成减数分裂和发育进程；克隆出的牛犊与供体奶牛遗传物质相同，但也不是100%的复制，原因可能是生物的性状受细胞核基因和细胞质基因共同控制;生物的性状还受环境因素的影响；生长发育中发生基因突变。(3)培育过程中为提高胚胎的利用率，可采用胚胎分割移植技术对囊胚的内细胞团进行均等分割，为了使胚胎移植能成功，需要对代孕奶牛进行同期发情处理，使之与供体的生理状况保持相同。答案