微生物基本操作技术ppt课件

1、微生物根本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC姚 粟.内 容微生物分类微生物接种和培育微生物的分别微生物的鉴定微生物保藏质控微生物.一、微生物分类.一、微生物分类-微生物的进化和多样性普遍性系统发育树,亲缘关系根据rRNA序列比较来决议。G. J. Olsen and C. R. Woese, Ribosomal RNA: A key to Phylogeny in the FASEB Journal, 7:113-123,1993.一、微生物分类原核生物大小: 0.5-3 mm外形:- 球型 (Sthaphylococcus)- 棒状(Escherichia coli)- 螺旋

2、(Rhodospirillum)生长迅速，20min至几小时可繁衍一代可利用多种碳源 真核生物细胞器：线粒体内质网高尔基体液泡.一、微生物分类/cells/animals/images/animalcell.jpg/cells/procaryotes/images/procaryote.jpg.原核生物一、微生物分类.真核生物一、微生物分类.一、微生物分类-多相分类表征表型特征形状特征生理和代谢特征生态特征遗传基因型特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列多相分类Polyphasic Texonomy Technology.一、微生物分类-微生物的分类等级“种是微生物分类中最根本的分类单元。“种 的

3、定义：一个种基因型种是有类似G+C组成并经过DNA杂交实验判别由70%或更大类似性的菌株的集合。分类等级界Domain门Phylum纲Class目Order科Family属Genus种Species.二、微生物接种和培育.二、微生物接种和培育微生物接种定义 将微生物的纯种或含菌资料如水、食品、空气、土壤、排泄物等转移到培育基上，这个操作过程叫微生物的接种。接种工具 微生物接种技术分类斜面接种液体接种穿刺接种平板接种 .二、微生物接种和培育斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；右手先将棉塞硅胶塞拧转松动，再拿接种环；用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧

4、；接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。.二、微生物接种和培育.二、微生物接种和培育液体接种操作方法与斜面接种根本一致，只是将接种环送入液体培育基中时使接种环与管壁接触的地方悄然磨擦，使菌体分散；塞上棉塞，悄然摇动均匀；假设菌种培育在液体培育基中，运用移液管或滴管接种。.二、微生物接种和培育.三、微生物接种和培育穿刺接种用接种针调取菌种后，插入深层固体培育基内不要刺究竟部，再沿原路拔出；此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动才干。.二、微生物接种和培育.二、微生物接种和培育平板接种平板接种的目的是察看菌落形状、分别纯化菌种，以及活菌计数等；平板接斜面：平

5、板分散的单菌落接于斜面；斜面接平板：点种法、划线法。.二、微生物接种和培育.三、微生物分别.微生物纯培营养别技术纯培育物是指来源于同一单细胞的细胞群体。获得纯培育物对微生物学研讨至关重要。.微生物纯培营养别技术涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培育基分别法单细胞孢子分别法选择培育基分别法.涂布平板法1、少量样品加到平板中央0.1mL；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培育基外表，适当条件下培育。.涂布平板法样品需适当稀释30-300CFU/mL.平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法.平板划线法斜线法：用接种环以无菌操

6、作挑取菌悬液一环，先在平板培育基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培育皿70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后经过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法经过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培育基上作延续划线。.平板划线法血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌大的金黄色菌落.平板倾注法对起始样品进展延续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培育基倒入无菌平皿后混合均匀，培育后获得单菌落。培育基外表菌落为圆形，而培育基内部菌落呈豆状或透镜状。.稀释摇管法适宜厌氧菌的纯培营养别无菌琼脂培育基试管加热使琼脂熔化后冷却并坚持在50左右

7、 梯度稀释后的待分别菌株参与试管中 摇匀、冷凝在琼脂柱外表倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物 培育后，菌落构成在琼脂柱的中间 .液体培育基分别不能在固体培育基上生长的微生物仍需求用液体培育基分别来获得纯培育。稀释法是液体培育基分别纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数普通应超越95%表现为不生长。 .单细胞孢子分别单细胞或单孢子分别法是采取显微分别法从混杂群体中直接分别单个细胞或单个个体进展培育以获得纯培育。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培育 。 单细胞分别

8、法对操作技术有比较高的要求。.选择培育基分别选择培育基特性促生长才干抑制才干指示鉴别才干.选择培育基分别传统选择性培育基血平板：适于各类细菌的生长，普通细菌检验标本的分别，都应接种此平板。营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培育基。麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分别。碱性琼脂：用于从粪便中分别霍乱弧菌及其它弧菌。.选择培育基分别新型显色培育基利用微生物本身代谢产生

9、的酶与相应显色底物反响显色的原理来检测微生物的培育基。OrganismEnzyme Substrate Color Coliforms-galactosidaseX-GALBlue Escherichia coli-galactosidase -Glucuronidase MUGfluorescenceEscherichia coli O157-galactosidaseX-GALBlue.选择培育基分别.基于酶与底物反响的显色培育基技术CHROMagar.Petrifilm 3MAerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform C

10、ount Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate 基于酶与底物反响的显色培育基技术.四、微生物鉴定.四、微生物鉴定多相鉴定分类)polyphasic taxonomy是利用微生物从分子特性到生态特征的多种不同信息，综合表型和基因型特征进展微生物分类鉴定的方法。.四、微生物鉴定-形状学察看细菌酵母丝状真菌宏观形态（培养特征）将培

11、养物划线或稀释涂布，30培养1624小时，选取划线或稀释涂布分离得到单菌落，观察和记录菌落的形状、大小、质地、边缘、颜色、光泽、透明度、隆起等。将培养物划线接种于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25培养23 d后，进行菌落形态观察，菌落质地、菌落颜色、菌落表面是否为反光或暗淡、菌落是平伏还是隆起、菌落边缘等。标准培养基（CA、CYA、WA）平板倒转，向上接种三点，每个菌株接种两个平板，倒置于25温箱中进行培养7天。观察菌落直径、颜色、质地、渗出液、菌落反面颜色等特征。微观形态（细胞特征）将培养物在30条件下培养1624小时，挑取对数期的单菌落，涂布于事先滴加少量无菌水的载玻片上，自然干

12、燥，加热固定，进行革兰氏染色，将制好的染色涂片在100X40倍的显微镜下观察革兰氏染色情况、菌体形状、排列行状、菌体大小等细胞特征。培养物划线接种于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25培养23 d后，取酵母菌制作成水浸片，在显微镜下观察细胞形态和无性繁殖方式等。用无菌接种针挑取少量培养物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，用接种针将菌丝团分散开，盖上盖玻片（勿使产生气泡），制成水浸片，显微镜下观察菌体形态特征，包括分生孢子梗、分生孢梗茎、顶囊、梗基、瓶梗、产孢结构、分生孢子头、分生孢子等。.四、微生物鉴定-形状学察看.四、微生物鉴定-生理生化碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性

13、能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物.四、微生物鉴定-生理生化Division based on membrane composition:a) gram-negative have outer and inner membranes and a thin cell wall (Escherichia coli) b) gram-positive have no outer membrane, but have a thicker cell wall (Bacillus

14、subtilis)c) neither gram- nor gram+ - no cell walls (mycoplasm):85/fox/gram-st.jpg:85/fox/bact-mem.jpg.四、微生物鉴定-生理生化API (bioMerieux)(biochemical).四、微生物鉴定-生理生化BBL Crystal (Becton Dickinson)将传统的生化反响、酶底物呈色反响与荧光加强显色技术结合，设计鉴定反响最正确组合。六类鉴定实验板，可鉴定500种细菌.四、微生物鉴定-化学成分分析.四、微生物鉴定-基因型分析G+Cmol% 16S rDNA, 26S rDNA

15、D1/D2, 5.8S rDNA ITS region, -tubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes.DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) DNA-DNA hybridizationRAPD, RFLP, AFLP, SSCP, Eric-PCR, BOX-PCR, Rep-PCR , LAMP.四、微生物鉴定-基因型分析D

16、NA 指纹图谱分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCP ERICPCR 以细菌DNA中串联反复序列为引物， 经过扩增细菌基因组中广泛分布的短反复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比较分析，提示基因组间的差别，运用于菌株分型。 BOX-PCR根据BOX插入因子(大小为 154 bp, 由保守性不同的 box A(57 bp)、box B(43 bp)和 boxC(50 bp)等亚单位组成)设计引物, 扩增微生物基因组DNA 的反复性片段, 最后经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性。 REP -PCR 扩增细菌基因的反复DNA 片段来获得菌株特

17、异性遗传图谱, 其中反复 DN A 片段包含了一个高度保守的回文序列(REP)为 38 bp 的片段, 由1个保守回文段以及两端分别有6 个降解位点和1 个5 bp 的可变框构成。 PCR-SSCP是聚合酶链式反响与单链 DNA 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合，利用不同构象单链 DNA 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差别, 检测出DNA短片段中存在的单核苷酸突变,现已广泛运用于各种基因多态性的研讨。假丝酵母PCR-SSCP 副溶血弧菌ERICPCR 沙门氏菌REP -PCR .四、微生物鉴定-鉴定实例116S rDNA序列系统发育树infB基因序列系统发育树.2007年 Asperg

18、illus brasiliensis sp.nov.新种发表2021年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2021年 USP将ATCC 16404 更名 2021年 WDCM 将ATCC 16404 更名 图：ATCC 16888和ATCC 16404的培育特征和显微形状anos Varga, Sandor Kocsube , Bea ta To th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world

19、-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932图: Rep-PCR条码系统发育树(DiversiLab平台)Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform) .注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical

20、 Microbiology Forum Newsletter, 2021, Vol. 14 (10): 2-14表 ITS序列特殊位点碱基差别Table Difference of base position in ITS sequence四、微生物鉴定-鉴定实例2.2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表2021年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2021年 USP将ATCC 16404 更名 2021年 WDCM 将ATCC 16404 更名 图: 基于曲霉黑色组-微管蛋白基因序列的

21、N-J树Figure : Neighbour joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.注：图片来源于Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932图1: 基于IT

22、S DNA序列的黑色曲霉N-J树Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences.注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2021, Vol. 14 (10): 2-14四、微生物鉴定-鉴定实例2.各种规范中仍将继续采用ATCC 16404作为质控菌株。

23、各类规范中，其它被指定为参考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F) 98003) ,需求重新复核鉴定。黑曲霉？四、微生物鉴定-鉴定实例2.形状学鉴定CYA培育基, 25C培育7 dBiolog鉴定生长浊度实验ITS rDNA区序列分析ITS4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5: 5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3-微管蛋白基因序列分析Bt2a: 5-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3Bt2b: 5-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3反响体系：100 L, 10 扩增缓冲液10 L; DNA模板1 L ; dNTP (

24、每种2.5 mmol/L) 8 L; 引物(10 L/L)各2.5 L; Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.3 L; 无菌超纯水补足总体积100 L。反响程序：94C 5 min; 94C 1 min, 55C 1 min, 72C 1 min, 30个循环; 72C 10 min, 4C保管。四、微生物鉴定-鉴定实例2.形状学鉴定图 25C培育7 d菌种的宏观形状和显微形状Fig Macromorphology and micromorphology on 25C, 7 d注: A菌落形状; B: 分生孢子梗形状( 100); C: 分生孢子形状( 400).Note: A: Col

25、ony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100); C: Conidial morphology ( 400).该菌株的形状学特征符合黑曲霉A. niger的形状特征四、微生物鉴定-鉴定实例2.Biolog鉴定注: : 没有生长; +: 生长旺盛; w: 微弱(边境)生长; v: 可变.Note: : No growth; +: Strong growth; w: Weak growth; v: Varied growth.表 碳源利用情况Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC168

26、88Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麦芽糖Maltose+-甲基-D-葡萄糖苷-Methyl-D-Glucoside+D-海藻糖D-Trehalose+L-苹果酸L-Malic Acidv+-酮戊二酸-Ketoglutaric acidw苦杏仁苷Amygdalin+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鉴定-鉴定实例2.ITS rDNA区序列分析图 CMCC(F)98003的ITS rDNA区序列和-微管蛋白基因序列PCR扩增结果Fig ITS rDNA and -tubulin gene PC

27、R amplification results of CMCC(F)98003注: M: DL2000 marker; 1: ITS rDNA区PCR扩增结果; 2:-微管蛋白基因PCR扩增结果.Note: M: DL2000 marker;1: ITS rDNA PCR amplification result ; 2:-tubulin gene PCR amplification result.表 ITS序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequence碱基位点Base position140166172173Asperg

28、illus brasiliensis IMI 381727CCTCAspergillus niger ATCC 16888ATAACMCC(F)98003ATAA注: 以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C为1位点.Note: The first C in the border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1.四、微生物鉴定-鉴定实例2.ITS rDNA区序列分析以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C为1位点。140166172、173四、微生物鉴定-鉴定实例2.

29、ITS rDNA区序列分析图 基于ITS区rDNA序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences注: 图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值, 图例为遗传间隔.Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.CMCC(F)98003与与A. ni

30、ger ATCC 16888聚类在分类间隔最近的一个分支上, 序列类似性达100% 。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性也具有很高的类似性, 序列同源性均在98.6%100%之间。四、微生物鉴定-鉴定实例2.-微管蛋白基因序列分析图 基于-微管蛋白基因序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig Neighbour-joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注: 图中发育树节点只显示Bootstrap 值大于50%数值, 图例为遗传间隔.Note: Numbers above br

31、anches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.CMCC(F)98003与黑曲霉A. niger CBS554.65T序列同源性为100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性均在94.7%以下。结合形状学、碳源利用情况和ITS rDNA序列系统发育分析等多相鉴定的结果, 将CMCC(F)98003鉴定为黑曲霉Aspergillus niger 。四、微生物鉴定-鉴定实例2.五、微生物保藏.菌种是进展微生物学研讨和运用的根本资料，是开展生物工程的重要根底

32、条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必需具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所担任保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，防止菌种的污染或死亡。 五、微生物保藏.制定专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保管；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中； 对菌种的入库和出库记录入档，实行双人担任制管理； 设专人担任管理菌种保藏设备正常运转，定期检修维护。 五、微生物保藏.微生物菌种保藏方法根本原理是在挑选优良纯培育物并使其处于休眠形状根底上，人为地发明一个有利于休眠的环境，使其长期保管后仍能坚持菌种原有的优良特性。根本措施是低温、真空

33、、枯燥。五、微生物保藏.常用菌种保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻枯燥法-80低温冻结法液氮超低温冻结法.定期移植法亦称传代培育保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培育基上，最适条件下培育，完成培育于46进展保管并间隔一定时间3-6个月进展移植培育的一种短期菌种保藏方法。操作步骤： 斜面制备 接种 培育 保藏. 斜面制备培育基配制分 装灭 菌摆放斜面. 接 种.培育细菌37 ，1-2d酵母 2830，23d丝状真菌26 ，57d保藏46保藏36个月 培育和保藏.定期移植法操作简单，运用方便；对设备和人员要求不高；可随时运用，便于察看菌种；任务劳动强度大，属短期保藏，保藏本钱高；菌种传代频繁，易退

34、化、污染。.液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培育基上，最适条件下培育好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温46枯燥处进展保管的一种菌种保藏方法。. 操作步骤：液体石蜡预处置斜面培育物制备灌 注 石 蜡保 藏优质化学纯液体石蜡灭菌： 121湿热灭菌30min，蒸发水分； 160 干热灭菌2h；冷却至室温。液面高出斜面顶部1cm46 ，枯燥处；直立放置；保藏时间1 2年。.液体石蜡法操作简单，运用比较方便；对设备要求不高，对人员操作程度有一定要求；菌种易退化、污染。.真空冷冻枯燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于维护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保管的一种

35、长期菌种保管方法。.安瓿管的预备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡810h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗23次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约1020mm。喷码于安瓿管外，160固定20min。灭菌 121 ，30min.维护剂的预备维护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，25ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113灭菌20min；翻开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30培育2天，无菌检查合格后备用。 .冻干样品制备制备斜面培育物；将维护剂用无菌吸管注入到斜面培育物上，用吸管刮取斜面上的

36、菌体，使菌体均匀地悬浮在维护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.10.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。.真空枯燥 在开动真空泵后应使真空度在15min内到达66.5Pa，随后逐渐到达26.613.3Pa，在此条件下，样品将坚持冻结形状，其中水分那么不断升华，枯燥才干顺利地进展。终止枯燥时间应根据以下情况判别：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用12支对看管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为枯燥结束.预冻制备菌悬液、经分装到进展预冻之间的时间不宜超越1h；分装完成后将安瓿管立刻

37、放入3540冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置20冻30分钟，再放入80冰箱冻30min；采用离心式冻干安装时勿需预冻。.熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时留意火焰不要离菌体太近。.真空度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，阐明真空度符合要求。.保藏 46下避光保藏，普通可保藏810年。 .真空冷冻枯燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5 10年)；对设备要求高(真空冷冻枯燥机、多歧管)，对人员操作程度要求高；冷冻枯燥过程对菌体有损伤，需恢复培育。.-80冰箱冻结法将菌种悬浮于维护剂

38、中，在80冰箱中冻结保管的一种长期菌种保藏方法。预备冷冻管预备维护剂 10%-15%甘油预备菌悬液细胞、孢子或芽孢悬液制备冷冻管取菌悬液和维护剂至冷冻管保藏 -80，25年.Microbank.-80冰箱冻结法运用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80冰箱)；运输不方便。.液氮超低温冻结法指悬浮于维护剂中的菌种经程控降温后，移置于196的液氮或150左右的液氮气相中保管的一种长期菌种保藏方法。.操作步骤冷冻管预备维护剂制备保藏培育物预备预冻 将程序降温系统预冷到4，将制备好的冷冻管放入其中，以1/min降温速率降至-35； 运用程序降温盒。保藏 将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150)或液

39、相(-196)。同“80冰箱冻结法 .液氮超低温冻结法保藏时间长；保藏效果好，菌种不易退化；对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作程度要求高；保藏本钱高。.不同保藏方法的比较.六、质控微生物.保藏菌株要求药品微生物检验用的实验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的规范菌株，或运用与规范菌株一切相关特性等效的商业派生菌株。922021版中国药典.国内认可的菌种收藏机构1979年7月，全国第一届菌种保藏管理睬议正式成立中国菌种保藏管理委员会CCCCM，委员会下设7个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心CCGMC, 中国科学院微生物研讨所农业微生物菌种保藏管理中心ACCC,中国农科院区划所工业