《遗传学》课件第06章 细菌的遗传分析

1、第六章 细菌的遗传分析本章重点：细菌杂交转化和转导学时数：3-4学时细菌的细胞和基因组细菌细胞比较小，有细胞壁拟核（nucleoid）无真核细胞特有的细胞器细胞分裂就是生长繁殖细菌的分裂细菌的基因组细菌染色体细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没有组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。（这种结构有利于外源DNA的插入。）E.coli基因组概况E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um.2001年10月15日完成了E.coli K12菌株的基因组全序列测定。总共4639221 bp， 4279个蛋白质编码基因，115个编码rRNA和tRNA的基因。（GenBank编号

2、:U00096）E.coli基因组注释图（部分）彩框表示编码蛋白质的基因。大肠杆菌的突变型及筛选细菌可以在人工培养基上培养，形成的群体称为菌落。 colony基本培养基和完全培养基；野生型（原养型）和突变型Wild-type mutant枯草芽孢杆菌的菌落大肠杆菌的突变型合成代谢功能的突变型 Anabolic functional mutants分解代谢功能的突变型 catabolic functional mutants抗性突变型 resistant mutants 大肠杆菌基因符号的命名Demerec 法则规定： 表型（首字母大写，正体） Gal+ ，Gal-；Tetr，Tets 基因型

3、（斜体） gal+ gal- ；tetr tets - 表示缺陷型或突变型 相同表型的不同基因突变（基因座）则在3字母后加大写字母，如metA， metB，细菌中常用的突变型基因符号ara阿拉伯糖不能利用mtl甘露糖醇不能利用arg精氨酸缺陷型pdx吡多醇缺陷型att原噬菌体附着点phe苯丙氨酸缺陷型ade腺嘌呤缺陷型pro脯氨酸缺陷型azi叠氮化钠抗性pur嘌呤缺陷型bio生物素缺陷型pyr嘧啶缺陷型cys胱氨酸缺陷型rha鼠李糖不能利用gal半乳糖不能利用str链霉素抗性his组氨酸缺陷型thi硫胺缺陷型lac乳糖不能利用thr苏氨酸缺陷型leu亮氨酸缺陷型tonphageT1抗性lys赖

4、氨酸缺陷型trp色氨酸缺陷型mal麦芽糖不能利用tsxphageT6抗性man甘露糖不能利用tyr酪氨酸缺陷型met甲硫氨酸缺陷型xyl木糖不能利用aramtlargpdxattpheadeproazipurbiopyrcysrhagalstrhisthilacthrleutonlystrpmaltsxmantyrmetxyl大肠杆菌的突变型的筛选分解功能突变型Media中加入呈色底物，利用分解产物与底物的反应或不反应抗性突变型Media中加入抗生素或phage合成功能突变型(营养缺陷型)用影印培养或点种法影印培养点种法诱变后培养在完全培养基上，缺陷型和野生型都能生长点种于含单一营养物质的基本

5、培养基上如果在所有平板上都能生长，是野生型；只在其中一个平板上生长的，就是所加营养物质的缺陷型大肠杆菌的杂交接合（conjugation）细菌的杂交1946，Lederberg和Tatum用 A菌株 met- bio- thr+ leu+ thi+ B菌株 met+bio+ thr- leu- thi-做混合培养，涂基本培养基平板，长出了几十个菌落，发生频率为10-7表明met+ bio+ thr+ leu+ thi+组合到同一细胞中A B完全液体培养基基本固体培养基平皿野生型从何而来？回复突变？转化？营养互补？基因重组？突变率一般为210-7 ， 两个基因同时突变4 10-14 三个基因同时

6、突变8 10-21U型管试验滤器孔径极小，保证细胞不能通过，避免细胞接触。分别培养A、B菌株，通气保证培养液物质交换。 分别涂平板，都没有菌落生长。结论A、B菌株有细胞接触，并发生了重组。不同品系的大肠杆菌可以杂交(接合)，并进行基因重组。杂交时的贡献Hayes发现，两个菌株在杂交时贡献不一样A(strr)与B(strs)A(strs)与B(strr)在不含str的基本培养基上都能得到菌落但在含str的基本培养基上，只有A(strs)与B(strr)能得到菌落，说明遗传物质是单向转移的过程大肠杆菌的性别在杂交中提供遗传物质的A菌株相当于雄性，记作F+，因为在细胞中有F因子接受遗传物质的B菌株相

7、当于雌性，记作F-，在细胞中没有F因子F因子F factor/element细菌染色体之外的能独立增殖的环状DNA，含形成性伞毛的基因。又称性因子(sex factor)或致育因子(fertility factor)，可以转移。约6104bp，约为E.coli染色体的2% 配对区域(pairing region) 致育基因(fertility gene)原点(origin)质粒、附加体质粒plasmid：指染色体外的遗传物质，可以自我复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。附加体episome：有些质粒除了可在染色体外自我复制外，还可以整合到细菌染色体上，成为细菌染色体的一部分，随着细菌染色体的复

8、制而复制。F因子的结构F因子F+通过性伞毛与F-结合，传递遗传物质。F-得到F因子变成F+; F+失去F因子变成F-。F+ F-杂交通常只转移F因子，染色体上基因转移的频率很小，不到10-6高频重组 研究中发现，有一个菌株与F-杂交时， F-很少转变成F+，但后代中重组子频率很高，达到10-2，这一菌株被称为高频重组菌株(high frequency recombination strain,Hfr菌株)。Hfr细菌重组的特点F因子通常最后进入F-菌株， F-菌株得到的往往是染色体片段，仍然为F-菌株。部分二倍体(partial diploid)外基因子exogenote 供体提供的染色体片段

9、内基因子endogenote 受体本身的染色体细菌的重组Hfr菌株的进入F-菌株的不完全的基因组（外基因子exogenote）与F-的染色体（内基因子endogenote ）之间发生交换。部分二倍体（半合子merozygote）：指同时具有内基因子和外基因子的细菌细胞。F因子的整合与Hfr菌株的形成在F因子和染色体上都有插入序列（IS），当相互配对发生交换时，F因子就整合到染色体上。由于IS在染色体上存在极性，整合后的F因子的方向就确定了。F+ 菌株 Hfr菌株F因子的环出 细菌的交换和重组的特点F-受体很少得到完整的F因子，因此大多数重组子仍为F-。只有整条Hfr染色体都转移时，F-才能得到

10、完整的F因子,变成F+(Hfr)。只有偶数次交换才能保证细菌染色体的完整性，产生平衡的有活性的重组子；如果内外基因子之间发生单交换，则环状染色体被破坏，产生不平衡的部分二倍体线性染色体，不能复制，细胞不能繁殖；3）重组子只有一种类型， 相反的重组子(reciprocal recombinant)不会出现。所以细菌的交换不是一个交互过程，而是单向的。中断杂交技术Wollman 和 JacobHfr thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs F- thr- leu- azis tons lac- gal- strr混合培养，隔一段时间取样用搅拌器搅拌，稀释涂平板（含st

11、r不含thr、leu，只有thr+ leu+ strr 的重组子才能生长）。重组子用影印培养方法检定其他非选择性标记基因 根据供体基因进入受体细胞的顺序绘制连锁图的技术中断杂交试验示意图影印培养中断杂交作图根据中断杂交结果判断不同基因进入受体的顺序，并以时间和顺序作出基因连锁图。0 5 10 15 20 25 minO azi ton lac galE.coli 的连锁群F因子大肠杆菌环状染色体的推测用不同的Hfr菌株进行中断杂交试验得到不同的连锁图。 Hfr H 0 thr azi lac tsx gal trp mal xyl met thi F Hfr C 0 tsx lac azi t

12、hr thi met xyl mal trp gal F Hfr J4 0 thi met xyl mal trp gal tsx lac azi thr F Hfr P72 0 met thi thr azi lac tsx gal trp mal xyl F菌株H和P72顺序一致，只是起点不同菌株C和J4正好与H和P72相反大肠杆菌环状染色体的推测F因子的插入决定了Hfr染色体的极性，F因子位于末端，相对的是原点（转移起始位点）大肠杆菌的遗传学图大肠杆菌全部染色体转移需要90min。52个准确定位的基因座位，五六百个初步定位。重组作图中断杂交技术得出的基因连锁关系是以时间为单位的，当时间单

13、位在两分钟时，所测得的图距就不准确了。必须用重组作图。Hfr lac+ ade+ strs F- lac- ade- strr 已知ade在lac之后转移，lac和 ade间的图距为1分钟。在不含ade的str平板上筛选重组子ade+ strr （ lac+ 也转移） EMB平板（伊红美蓝培养基）lac+菌落为紫红色，表明lac 和ade间无交换Lac-菌落为粉红色，表明lac 和ade间有交换F菌株1959年，Adelberg发现，用一菌株（Hfr）F-可以高频率地转移特定的基因和育性。F因子含有某一小段染色体基因的F因子可能带有不同的细菌基因与缺陷型噬菌体不同，本身的基因并不减少。F菌株含

14、有F因子的细菌，可以借整合形成Hfr，介于F+和Hfr之间。能正常转移，使受体转变为F，并在受体细菌中形成部分二倍体。杂交过程中遗传物质的转移F+lac+F-lac-F-lac-F+lac+Flac+F-lac-性导性导Sexduction： F因子转移后可形成部分二倍体的过程。通过性导可以转移细菌的特定基因。也可以将受体菌株变为F菌株。性导的研究用途F因子在受体中能自主复制传递可以用作不同突变型间的互补测验确定部分二倍体中“等位”基因的显隐性关系利用不同的F因子性导来测定不同基因在一起性导的频率进行作图F、F和Hfr菌株的关系吖黄素F+ F- HfrF+ F- F+ F-结合高频重组低频重组

15、整合FF重组频率较低Hfr转移细菌染色体的频率高，而F因子很少进入受体。 F和F容易转移使F-变成F+或F ，但细菌染色体很少进入。转化与转导转化(transformation)转导(transduction)谁先发现了细菌转化现象？细菌的转化与作图转化频率低，通常为1%受体表面的允许DNA通过的受体位点(receptor site)是有限的DNA的进入还需要酶或pr以及能量的协同作用感受态细胞(competence cell)：能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞。细菌转化的过程转化时DNA片段约20kb，进入受体后形成部分二倍体，一旦重组就可以使受体发生稳定的性状DNA 分子与细胞表面受

16、体部位结合DNA片段进入细胞一条单链被降解，剩单链DNA单链DNA插入受体的DNA链中，形成部分杂合的DNA分子经复制、重组、分离后，形成各种类型的转化子(transformants)细菌的转化供体DNA片段可以携带多个基因，可能同时转化但同时转化的基因不一定连锁，因为可能有2个或多个片段进入细胞连锁基因共转化和非连锁基因共转化的频率不同，但DNA浓度降低时，非连锁基因共转化的频率比连锁基因共转化频率低细菌的转化与作图 未转化类型不能作为亲本型，如计算trp2和his2时，+和+tyr1是亲本型，而trp2his2+不统计。 trp2 his2 tyr1 34 13 40转染Transfect

17、ion，是转化的特殊方式，指用裸露的噬菌体DNA感染细菌并使其在细菌中表达。用真核细胞为受体时，任何裸露DNA的吸收都称为转染。转导与作图转导transduction：以噬菌体为媒介,将细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌。转导的发现 Lederberg和学生zinder研究沙门氏菌杂交时，基本培养基上出现10-5的野生型，发现U型管试验也得到10-5的野生型，表明隔开也能产生重组类型。普遍性转导(generalized transduction)后来证实是由温和噬菌体P22引起的。普遍性转导的频率较低,约为10-5,相距较远(超过phage包装大小)的两个基因同时转导的频率则更低

18、, 仅有10-5 10-5=10-10定义：P1、P22等噬菌体可以转移细菌染色体的许多不同部分，称为普遍性转导普遍性转导决定噬菌体感染能力的是噬菌体的蛋白质外壳普遍性转导约0.3%的子代噬菌体为转导噬菌体，而被包装入噬菌体头部的DNA片段约为细菌基因组的1%，所以转导频率一般为310-5共转导cotransduction两个或以上基因一起转导进受体两个基因共转导频率越高，表明两个基因连锁越紧密；共转导频率低则表明两个基因距离远。共转导P1噬菌体供体菌：thr+leu+azir 受体菌： thr-leu-azis 选择标记 非选择标记 1 leu+ 2% thr+ 50%azir 2 thr+ 3%leu+ 0azir 3 thr+leu+ 0azir thr leu azi由于thr-leu的长度正好为噬菌体染色体的大小，所以thr+leu+ 转化子并不转移azir共转导同染色体上2个基因间的物理距离： d = L(1- 3 x ) 其中：d表示2个基因间图距 L表示转导的DNA长度 x表示2个基因共转导频率流产转导abortive transduction只有10%的转导能发生重组，形成完全转导，长成正常菌落。90%的转导只将供体基因导入受体，不能重组，因而不能复