重组体在原核细胞中的表达与调控课件

1、重组体在原核细胞中表达与调控第1页，共35页。基因表达概述基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂的生化反应，产生具有生物学功能的蛋白质过程，即DNARNA蛋白质.基因表达调控转录水平调控转录产物加工mRNA从核到细胞质mRNA降解翻译水平第2页，共35页。原核与真核生物基因组比较真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启

2、或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多第3页，共35页。原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约10%的序列是编码蛋白质或rRNA、tRNA等的基因，其余约90%的序列功能至今还不清楚原核生物基因的蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子和内含子，在转录后经剪接去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增

3、加了基因表达调控的环节原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列。绝大多数真核生物的蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因 第4页，共35页。原核基因转录特点原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种），识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的；形成多核糖体，可在一条mRNA链上同时合成多条肽链，效率高mRNA可从两条链中任一条有意链上转录，转录方向与DNA方向相反（3 5 ），并且在mRNA还没有合成完时，翻译就开始基因表达调控在转录水平，两种方式：起始控制（启动子），终止控制

4、（衰减子）原核具有SD序列，即同16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列操纵子结构第5页，共35页。外源基因在原核表达的条件通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白外源基因不能带有间隔序列（内含子），如cDNA或全合成的基因利用原核强启动子及其两侧的调控SD序列与起始子密码子ATG有合适的距离外源基因下游加上不依赖因子的转录终止区正确的开放读码框架利用宿主调控系统，调节外源基因表达，防止产物毒害宿主第6页，共35页。外源基因在原核表达调控元件启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列Pribnow box：-10区；TATAAT（与RNA聚合酶核

5、心酶结合，解旋DNA，合成RNA）-35区：TTGACA（与因子结合）代表强启动子：乳糖启动子（Lac）；色氨酸启动子（Trp）；噬菌体左向启动子（PL）；Trp-Lac杂合启动子（Tac）；T7噬菌体启动子第7页，共35页。第8页，共35页。乳糖操纵元 凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵子。 乳糖操纵元：转录负调控基因：操纵基因（O）；启动子（P）；3个结构基因（Z、Y、A）诱导剂：IPTG第9页，共35页。乳糖操纵元基因图和表达调控第10页，共35页。第11页，共35页。第12页，共35页。色氨酸操纵元 色氨酸

6、是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元（trp operon）的调控。 第13页，共35页。两种调控方式阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白+色氨酸有活性的阻遏蛋白+操纵基因无活性的操纵基因衰减子依赖与色氨酸浓度或其他氨基酸浓度诱导物：-吲哚丙烯酸第14页，共35页。第15页，共35页。PL和PR启动子噬菌体CI基因负调控温度敏感的启动子：3242原理：在42时，CI蛋白失活工作方式宿主合成CI蛋白载

7、体编码CI蛋白第16页，共35页。核糖体结合位点（SD序列） 在mRNA分子中起始密码子AUG上游8-13bp处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，由3-9bp组成，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，因此有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD顺序。第17页，共35页。第18页，共35页。大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3-端的互补性16S rRNA 3 HOAUUCCUCCAUAG.5噬菌体MS2外壳蛋白 5.UCAACCGGAGUUUGAAGCAUG.

8、3复制酶 5.CAAACAUGAGGAUUACCCAUG.3噬菌体Cro 5.AUGUACUAAGGAGGUUGUAUG.3galE 5.AGCCUAAUGGAGCGAAUUAUG.3-内酰胺酶 5UAUUGAAAAAGGAAGAGUAUG.3脂蛋白 5.AUCUAGAGGGUAUUAAUAAUG.3核糖体蛋白质S12 5.AAAACCAGGAGCUAUUUAAUG.3RNA聚合酶5.AGCGAGCUGAGGAACCCUAUG.3trpE 5.CAAAAUUAGAGAAUAACAAUG.3第19页，共35页。终止子终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列两类

9、终止子（按其作用是否需要因子的协助 ）不依赖因子（蛋白性终止因子）的终止子：在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列，其后跟随一段富含AT的序列，因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。依赖因子的终止子，即其终止转录的作用需要因子的协同，或至少是受因子的影响。抗终止因子：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用 第20页，共35页。rrnB强终止子第21页，共35页。原核表达载体克隆载体：用于外源基因在宿主细胞中复制扩增（松弛

10、型复制子）表达载体：适用与在宿主细胞中表达外源基因融合表达非融合表达第22页，共35页。组建表达载体条件强启动子两侧的调控序列选择标记正确的读码框架合适的核糖体结合位点（SD序列）SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离质粒的稳定性被翻译出的蛋白的性质和稳定性合适的宿主细胞第23页，共35页。融合型表达与天然表达融合型表达通常N-末端短的原核多肽（6His；GST；FLAG；MBP等），易亲和纯化具有真核抗原性抵御内源性蛋白酶降解可作为信号肽，进行细胞内定位天然型表达N-末端为Met接近与生物体内的天然蛋白可应用与本身生物易被宿主蛋白酶降解第24页，共35页。代表载体pKK223来源于pBR3

11、22非融合型表达Tac启动子pUC8多克隆位点rrnB rRNA转录终止子宿主：LacI宿主（JM105）IPTG诱导第25页，共35页。表达载体第26页，共35页。代表载体pIN分泌型表达脂蛋白基因启动子（IPP）LacUV-5启动子和操纵基因Lac阻遏子基因大肠杆菌分泌蛋白基因外膜蛋白基因（OmpA）片段三种密码子读码框架的多克隆位点产物分泌至细胞间隙或培养基第27页，共35页。第28页，共35页。代表载体pGEX融合型表达融合谷胱肽巯基转移酶Tac启动子Lac操纵基因SD序列LacI阻遏蛋白基因亲和层析纯化融合蛋白凝血酶或Xa因子切割融合蛋白成完全天然蛋白第29页，共35页。第30页，共35页。外源基因的要求反转录制备cDNA人工合成基因PCR扩增目的基因第31页，共35页。提高外源基因表达水平的措施第32页，共35页。提高翻译水平调整SD序列与起始密码子AUG之间距离点突变改造碱基，尤其是起始密码子紧随的几组密码子，原因是改善翻译起始和mRNA结构增强RNA的稳定性，如插入“重复性基因外回文顺序”使用原核偏爱密码子第33页，共35页。减轻细胞代谢负荷诱导表达，使细菌生长与外源基因表达分开表