《医学细胞生物学》本科课件15章 细胞衰老与死亡2015

1、第十五章 细胞的衰老与死亡教材名称 医学细胞生物学目 录第一节 细胞衰老1第二节 细胞死亡2一、细胞衰老的概念细胞衰老（cell aging或cell senescence）是指随着时间的推移，细胞增殖能力和生理功能逐渐下降的变化过程。正常成纤维细胞衰老的成纤维细胞的不同形态学改变细胞衰老有两层含义一是指其增殖分化的停止，二是指其同时能够维持细胞基本的代谢活动。细胞衰老是机体的衰老和老年病发病的基础.（一） 细胞衰老与机体衰老细胞的衰老与机体的衰老既有区别又有联系机体衰老是指随着年龄的增加，机体功能呈现退行性变化，并伴随生殖能力下降和死亡率上升的过程，是一个受发育程序、环境因子等多种因素控制的

2、、不可逆的生物学现象。细胞衰老是机体衰老的基础和直接原因，机体衰老是建立在总体细胞衰老的基础上，各种衰老都有其细胞学基础。（二） 机体内各类细胞的寿命1. 不能更新组织细胞 细胞高度分化，细胞在个体发育早期增殖分化成熟后，一般情况下不能再分裂与分化，即机体一生中没有同类细胞更替补充。2. 相对稳定组织细胞 细胞的分化程度较高，通常不分裂，但终生保留有分裂的能力，一般在同类细胞受到损伤导致细胞数量减少时重新进入细胞周期，进行分裂繁殖。3. 不断更新组织细胞 指某些特化的组织细胞，它们在执行自身生命活动的过程中会发生自然衰老死亡，同时由新生细胞不断再生成熟来补充。可分为3种：干细胞，具有自我更新和

3、多向分化能力；过渡细胞，由干细胞增殖分化而来，是能随着细胞分裂趋向成熟的中间细胞；成熟细胞，不再分裂，在执行生命活动的过程中逐步衰老和死亡。4.可耗尽组织细胞 如人类的卵巢实质细胞，在一生中逐渐消耗，而不能得到补充，最后消耗殆尽。一般情况下，体内更新较快的细胞，其寿命较短；体内基本不更新的细胞，在分化成熟后可以保持与机体相同的寿命。成年小鼠各类细胞的寿命（三）细胞在体外培养条件下的寿命 Hayflick界限（Hayflick limitation）体外培养的二倍体细胞的增殖能力和寿命不是无限的，而是有一定的限度。体外培养的二倍体细胞的增殖能力反映了它们在体内的衰老状况，而且其分裂次数与供体年龄

4、之间成反比的关系。不同物种的细胞最大分裂次数与动物平均寿命成正比的关系。（四）细胞的复制衰老和胁迫诱导衰老1. 细胞的复制衰老复制衰老（replicative senescence，RS）是指体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞逐渐衰老直至死亡的现象，即前面提到的Hayflick界限。2. 细胞的胁迫诱导衰老环境因素对细胞产生胁迫压力，可诱导细胞产生胁迫性衰老，加速或提早使细胞出现衰老现象，也称为细胞病理性衰老。二、细胞衰老的表现（一）细胞衰老的形态结构变化1. 细胞体积缩小 衰老细胞内水分减少，结果使细胞萎缩、体积变小，原生质浓缩，黏稠度增加，失去正常的形态。2. 细胞膜变

5、化3. 细胞核的变化 核膜内陷（invagination），染色质的固缩化。4. 线粒体的老化 线粒体的老化是细胞衰老的重要原因之一。线粒体数量随细胞年龄的增大而减少，体积随年龄增大而增大。5. 内质网的老化6. 高尔基复合体的变化7. 致密体的生成 致密体（dense body）是衰老细胞中常见的色素颗粒状沉积，绝大多数动物细胞在衰老时都会有致密体的积累。8.细胞骨架体系的变化二、细胞衰老的表现（二）细胞衰老的生物化学变化复制能力的丧失及对促有丝分裂刺激的反应性减弱是细胞衰老的标志之一。细胞衰老时mRNA合成能力下降，mRNA与核糖体的结合能力降低。而rRNA和tRNA的变化没有明显的规律。

6、衰老细胞内蛋白质合成速率下降，酶含量减少、功能降低。三、细胞衰老的学说与机制（一）遗传程序学说该学说认为每一物种本身都有固有的遗传基因上的衰老程序，衰老是遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基因组；控制生长发育和衰老的基因按照预定程序在特定时期有序地开启和关闭。Werners syndrome Hutchinson-Gilford syndrome A mutant model mouse is useful for studies of aging. The klotho phenotype (premature aging) is caused by a disruption o

7、f the single gene, klotho. 三、细胞衰老的学说与机制（二）端粒-端粒酶学说端粒（telomere）是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复序列组成。人类的染色体端粒由TTAGGG/CCCTAA重复序列组成。端粒酶（telomerase）是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，常见于生殖细胞和肿瘤细胞等细胞中，而正常的体细胞中则缺乏端粒酶或端粒酶活性很低。端粒-端粒酶学说认为，随着细胞分裂端粒长度会逐渐缩短，端粒最终缩短到一定的长度或是改变端粒结构，端粒就会失去端粒结合蛋白的保护而激活衰老信号，诱导细胞衰老。（三）自由基学说该学说认为细胞在正常的代谢活动中

8、会产生自由基（free radical），自由基对细胞成分具有损伤作用，细胞的损伤积累引起了细胞的衰老。自由基是指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团，当自由基与其他分子反应时，产生的活性氧基团（reactive oxygen species，ROS）导致细胞结构发生氧化性损伤。自由基自由基导致细胞损伤：质膜中不饱和脂肪酸氧化，导致膜运输功能紊乱以至丧失。蛋白质的巯基化，造成蛋白质发生交联、变性，使酶失活。DNA链的断裂、交联、碱基羟基化、碱基切除等，对DNA造成损伤。人体内自由基产生的主要途径：环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基；体内各种代谢反应产生的内源

9、性自由基。内源性自由基是人体自由基的主要来源，其产生途径有：一是由线粒体呼吸链电子泄露产生；二是过氧化物酶体的多功能氧化酶（microsomal mixed function oxidases，MFO）等催化底物羟化产生。 清除自由基的防御系统 抗氧化酶系统：SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶 谷胱甘肽过氧化物酶。抗氧化剂：维A,C,E、硒、半胱氨酸，谷胱甘肽。（四）其他细胞衰老学说1. 大分子交联学说2. 错误成灾说3. 神经内分泌免疫调节学说四、细胞衰老与疾病一些人类疾病在生命的早期阶段就表现出衰老表型快速进展相关特征，这些疾病特征与正常衰老过程有着惊人的相似之处，称为早老性疾病。早老性疾病共

10、同特点是它们均存在DNA损伤修复缺陷。随着年龄的增加，成体组织中的干细胞也在逐渐衰老，干细胞的衰老将导致其自我更新和多向分化能力的衰退，甚至增殖分化失控，导致损伤组织难以修复、组织器官结构与功能的衰退，相关疾病相伴而生。目 录第一节 细胞衰老1第二节 细胞死亡2细胞死亡（cell death）是指细胞生命现象的终结。细胞衰老的结果是死亡，但细胞死亡并非都是由衰老引起的。传统的细胞死亡方式分类包括细胞坏死（necrosis）和细胞凋亡（apoptosis）两种。近年来国际上多数学者将细胞的死亡形式分为细胞凋亡、细胞坏死和自噬性细胞死亡三种。一、细胞凋亡（一）细胞凋亡的概念细胞凋亡（apoptos

11、is） 是多细胞生物调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的主动的生理性细胞自杀行为，是细胞生理性死亡的普遍形式。细胞皱缩、染色质凝聚、凋亡小体形成、细胞骨架解体等，其中以胞核的变化最为显著。(二)细胞凋亡的特征核浓缩、核膜皱缩1. 细胞凋亡的形态学特征凋亡的起始 细胞皱缩，体积变小，胞质浓缩； 细胞表面微绒毛消失，细胞间接触消失； 胞膜完整，但未失去选择通透性；磷酯酰丝氨酸外翻； 线粒体基本完整，但体积增大，嵴增多，出现空泡化； 内质网腔膨大； 核内染色质凝集，成新月形帽状结构，分布于核內缘（染色 质边聚），核浓缩、裂碎。 凋亡小体的形成 染色质断裂成片段，与某些细胞器聚集，被膜包围。A.

12、 正常细胞 B. 微绒毛消失 C. 凋亡小体扫描电镜下的凋亡细胞表面变化（山东大学辛华提供）凋亡小体（apoptosis body) 凋亡细胞经过类似胞吐的方式，形成的球形突起，内含胞质、细胞器以及染色质片段。凋亡细胞的清除 脱落的凋亡小体逐渐被邻近细胞或体内吞噬细胞吞噬，残余物被消化后重新利用。细胞凋亡最主要的特征是整个过程细胞膜保持相对完整，细胞内含无不发生外泄，不会引起炎性反应。 DNA片段化细胞凋亡时，内源性核酸内切酶活化，特异地在相邻核小体的连接区切断DNA链，形成长度为180200bp整数倍的寡聚核苷酸片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞表现出特征性的DNA梯状条带（DNA la

13、dders）。 2.凋亡细胞的生化改变凋亡细胞DNA凝胶电泳时呈现梯状条带A. 细胞凋亡中DNA内切酶的活化 B. 细胞凋亡所形成的180200bp整倍性DNA片段 2. 细胞凋亡中的蛋白酶 细胞凋亡是通过多种蛋白酶控制的，蛋白酶级联切割是凋亡最关键的过程。caspase天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶4线粒体在细胞凋亡中的作用呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡；释放细胞色素C（cytochrome C, cyt C），激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；产生活性氧类物质（ROS）线粒体膜通透性增高，触发级联反应。3. 胞浆Ca2+、pH的变化 胞浆内Ca2+浓度升高细胞凋亡与细胞坏死的形态

14、比较 细胞凋亡与细胞坏死的区别 特征 细胞凋亡 细胞坏死诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激受累范围 单个细胞丢失 成群细胞死亡膜完整性 保持到晚期 早期即丧失细胞体积 减少、固缩 增大、肿胀染色质 凝聚成半月形 稀疏成网状细胞器 无明显变化 肿张破坏溶酶体 保持完整 破坏外溢细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片基因组DNA 有控降解 随机降解大分子合成 一般需要 不需要基因调控 有 无后果 不引起炎症反应 引起炎症反应意义 生理死亡方式 病理死亡方式 电镜下的凋亡细胞(A-B)与坏死细胞(C)（三）细胞凋亡的检测方法1. 形态学观察应用各种染色法可观察凋亡细胞的形态学特征。台盼蓝、4，6-二脒基-

15、2-苯基吲哚（DAPI）、 吉姆萨（Giemsa）染色法DAPI 染色显示凋亡细胞的染色质凝集 A. 正常细胞核 B. 凋亡细胞核2. DNA电泳从凋亡细胞中提取的DNA在进行常规的琼脂糖凝胶电泳时，这些大小不同的DNA片段就呈现出梯状条带（DNA ladders）。这一方法是鉴定细胞凋亡最为简便可靠的方法之一。3. DNA断裂的原位末端标记法即转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（TUNEL）。这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3-OH进行原位标记。人淋巴瘤细胞经喜树碱处理4h后，使用TUNEL Assay Kit 检测。具有DNA链缺口的凋亡细胞可通过TUNEL和绿色荧光检测到，而坏死细

16、胞则被红色荧光的PI染色。 4. 彗星电泳法正常细胞的核无DNA 断裂泳动时保持圆球形凋亡细胞中的DNA 降解片段在电场中泳动速度较快，细胞核呈现出慧星式图案5. 流式细胞分析6. 检测细胞膜成分变化检测磷脂酰丝氨酸的外翻检测caspases 的激活检测Cyt c 的释放检测线粒体膜电位的变化等一、细胞凋亡（四）凋亡的信号通路与分子机制由天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶（cysteine aspartic acid specific protease，caspase）依赖的细胞凋亡信号转导通路主要有两条：死亡受体介导的信号通路线粒体信号通路共同特点:是富含半胱氨酸，被激活后能特异地切割靶蛋白

17、的天冬氨酸残基后的肽键。 启动凋亡 caspase-2、8、9、10 执行凋亡 caspase-3、6、7 每一条信号转导通路不是孤立存在的，它们相互联系，形成 网络。1. 死亡受体介导的信号通路死亡受体（death receptor，DR）是近年发现的一组细胞表面标记，细胞外的许多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体结合，激活凋亡信号通路，导致细胞凋亡。哺乳动物的死亡受体属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）和神经生长因子受体超家族，目前已知的死亡受体主要有Fas、TRAIL（TNF Related Apoptosis Inducing Ligand）及TNFR。它们都具有一个富含半胱氨酸的胞外结

18、构域和一个同源的细胞质序列，也称为死亡结构域（death domain，DD）。死亡结构域在死亡受体传导凋亡信号中起到至关重要作用，它们与相应的配体结合后，可以通过一系列的信号转导过程，将外源性凋亡信号传递到细胞内，引发细胞凋亡。 死亡受体介导的信号通路2. 线粒体信号通路线粒体是内源性细胞凋亡的调控中心。当细胞受到内部或外部的凋亡信号刺激后，都可引起线粒体的损伤和膜通透性的改变，进而促进线粒体释放凋亡启动因子。细胞色素c能与Apaf-1/Caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡复合体，然后募集并激活Caspase-3，进而引发Caspase级联反应，对凋亡信号进行放大，导致细胞凋亡。

19、线粒体信号通路3. 颗粒酶B通路细胞毒淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）可以通过释放裂解颗粒进入免疫突出突触来杀伤靶细胞。这些颗粒中包括两种关键的组成蛋白：穿孔素和颗粒酶B。穿孔素通过穿透靶细胞的质膜在靶细胞表面形成微孔道，有利于颗粒酶B进入靶细胞激发细胞凋亡。颗粒酶B是一种外源性的丝氨酸蛋白酶，它可通过裂解并激活凋亡的执行者caspases-3和caspases-7诱导凋亡相关的caspase级联反应。在人类，颗粒酶B还可通过调节BID的加工，激活凋亡线粒体通路，放大凋亡信号。颗粒酶B通路4. 执行通路Caspase的发现源于秀丽隐杆线虫（Caenorhabdits elegans）细胞凋亡的研究。现已发现caspase在凋亡过程中发挥着不同的作用，可分为两类：凋亡的起始者：包括caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10、caspase-11；凋亡的执行者：包括caspase-3、caspase-6、caspase-7。（五）凋亡的意义细胞凋亡不仅与发育有关，对于维持机体的平衡及一些系统的功能达到最佳状态，都具有非常重要的意义。对于多细胞动物个体，细胞凋亡在胚胎发育造型，细胞数量的精细调控及潜在危险性细胞的清除方面发挥着重要作用。 凋亡的意义（六）细胞凋亡与疾病人体细胞凋亡的异常，