生物制药抗体课件

1、抗体药物张忠山第三节 鼠源性单克隆抗体的改进改造鼠源性单克隆抗体的目的： 一是降低免疫原性； 二是降低相对分子量，增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道，见书中表4-4，给出了改造后的单抗的类型和特性。一、人-鼠嵌合抗体制备方法：提取杂交瘤细胞系的mRNA，经过逆转录成cDNA，并以其为模板，采用特异引物，用PCR方法分别扩增VL和VH基因，再分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，将VL基因克隆到人Ig的CL基因表达载体上，将VH基因克隆到人IgG1的C基因真核

2、表达载体上，再将人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，转染后用含霉酚酸进行筛选，形成集落的细胞即为共转染细胞，所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠IgG1或IgG2b，则可有效地加强多肽的ADCC效应与免疫调理作用。二、改形抗体如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体（reshaping antibody）又

3、称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）。书中表4-5给出几种改形抗体及其潜在的临床应用。三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的1/80-1/3。也就是说，保留了CDR区，而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型：（1）Fab抗体，由完整的轻链和重链（VH和CH1） 所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（single chain antibody SCA 或single chain FV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连

4、接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。四、双功能抗体双功能抗体就是双特异性抗体（biospecific antibody, BsAb）。它是一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法2、生物学方法（杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的 杂种-杂交瘤细胞。

5、3、基因工程方法 采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性（ SCFV)2。五、抗体融合蛋白抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新特性，称之为抗体融合蛋白。类型有： （1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。 （2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。 （3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。 （4）受体-FV型融合蛋白。 （5）酶-抗体型融合蛋白。其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化

6、成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。构建抗体融合蛋白的原则是：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。噬菌体抗体库技术的原理，简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。第四节 抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获得目的基因 2、抗体库技术的载体：现在普

7、遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。4、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程。二、噬菌体抗体库技术的特点1、模拟天然全套抗体库 抗体文库1011库容，能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物

8、采自多个人体，具有人的种属普遍性。VH和VL随机重组增加抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库中，VH 和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，因此产生的抗体必然都是高亲和力的。三、基因工程抗体的表达1、原核细胞表达：融合表达、分泌型表达2、真核细胞表达3、转基因植物表达4、转基因动物表达融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小

9、Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。第五节 抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂（1）鉴定病原菌用的抗体试剂A、常用诊断血清的品种和用途B、诊断血清的制备步骤a、制备细菌抗原：细菌接种-培养-收集菌苔-制成菌液。b、免疫动物和制备抗体血清：动物：家兔、马、羊、豚鼠。 免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-7次，每次间隔3-4d，末次注

10、射后6-8d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。 反向间接凝集反应B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠-获得抗HBs血清-硫酸铵盐析/柱层析-取其IgG -在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：RPHA法 在V型血凝板上进行，阴性

11、样品不凝集，许血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。（3）妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕。（4）抗ABO血型系统血清凝集原附着在红细胞表面，是一种抗原。凝集素存在于血浆（或血清）中，是抗同名凝集原的抗体。同名的凝集原和凝集素相遇（如凝集原A和抗A凝集素）会发生红细胞凝集。 红细胞上只有凝集原A的为A型血，其血清中有抗B凝集素；红细胞上只有凝集原B的为B型血，其血清中有抗A的凝集素；红细胞上A、B两种凝集原都有的为AB型血，其血清中无抗A、抗B凝集素；红细胞上A、B两种凝集原皆无者为O型

12、，其血清中抗A、抗B凝集素皆有。具有凝集原A的红细胞可被抗A凝集素凝集；抗B凝集素可使含凝集原B的红细胞发生凝集。 输血检测将供血者的红细胞与受血者的血清（主侧）及受血者的红细胞与供血者的血清（次侧），分别做配血试验，观察有无凝集反应。主侧出现凝集反应，为配血不合，不能输血，主侧无凝集反应，次侧出现凝集反应，为配血基本相合，在紧急情况下才可输血，但要特别慎重，不可输得太快、太多，并密切观察有无输血反应。 防止出现新生儿溶血症，O型血的妇女与A型、B型或AB型的男子结婚后，怀孕后所得的胎儿可分A型、B型、AB型。胎儿由父亲遗传而获得血型抗原为母亲所缺少，这中抗原通过胎盘进入母体，刺激母体产生相应

13、的免疫抗体，抗体又进入胎儿体内，抗原抗体相结合使胎儿细胞凝集破坏，发生溶血，可出现流产和死胎。母胎血型不合的新生儿可出现早发性黄疸，发生心力衰竭或黄疸后遗症，抢救不及时，则造成脑性瘫痪、呆傻甚至死亡。 二、免疫标记技术用的抗体类试剂给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规方法难以观察或检测的反应得以显现，因而大幅度提高抗原抗体反应的敏感性，用于对微量抗原物质进行定性或定量检测，结合显微镜或电子显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除用于临床诊断外，还能为探讨发病机制提供有力的研究手段。免疫标记技术有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫技术

14、。1、荧光抗体诊断试剂 荧光色素如异硫氰酸荧光素（FITC）等标记抗体球蛋白，即成为荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成为可发光的可视物，从而达到诊断或定位的目的。 （1）荧光抗体的制备 （2）免疫荧光测定法有直接和间接两种方法。2、免疫酶抗体诊断试剂 免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，本法分为免疫酶染色和酶免疫测定两种类型。 （1）免疫酶染色法用抗体诊断试剂：常用的酶为HRP，其底物为二氨基联苯胺（DAB），两者作用可生成棕褐色沉淀物质，使抗原呈色。 （2）酶免疫测定用抗体诊断试剂：重点掌握酶免疫法的基本概念。比如ELISA方法（夹心法、间接法）。（3）放射免疫用抗体诊断试剂 把同位素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。 常用的标记抗体试剂： HBsAg、HBeAg、 HAV抗原、AFP、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂。第六节 抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有20多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效