核酸的生物有机化学课件

1、第 三 章核酸的生物有机化学（上）13.1 核酸和生命遗传的化学本质 在活细胞的各种组分中，核酸是非常重要的生物大分子之一。 在自然界中，生物能够一代一代地遗传下去，而且它们的各种生物特性得以继续保留。 遗传物质是什么？ 遗传信息是如何传递的？ 遗传信息与蛋白质的氨基酸顺序有什么关系？在细胞中，遗传物质是一种特殊的生物大分子DNA（脱氧核糖核酸）。DNA兼具储存和传递“遗传信息”的双重功能。2 DNA遗传信息的传递，主要是由三个步骤组成。第一步，DNA的复制。实际上是将亲代DNA进行拷贝，得到子代DNA的过程。子代DNA保留了亲代DNA全部遗传信息。第二步，由DNA转录成RNA（核糖核酸）。在

2、这一步中，部分DNA的遗传信息被转录到RNA上。第三步，RNA 所携带的遗传信息翻译和表达成具有一定的氨基酸顺序的蛋白质。33.2 核酸（DNA和RNA）的结构 核酸（nucleic acids）包括DNA（deoxyri -bonucleic acid）和RNA（ribonucleic acid）两大类。DNA是最基本的遗传信息物质。RNA则起着帮助传递和表达遗传信息的作用。它们在结构上很相似都是链状聚合物。1. 构成DNA和RNA的结构单元分子 DNA和RNA都是由结构相似的结构单元分子连连接而成的多聚体。DNA和RNA的结构单元分子分别由三种简单分子所组成，即戊糖、含氮碱基和磷酸。4 戊

3、糖：组成DNA结构单元分子的是脱氧核糖（2-deoxyribose），组成RNA结构单元分子的是核糖（ribose）。D-核糖D-2-脱氧核糖5 含氮碱基和核苷：组成核酸结构单元分子的含氮碱基有五种。其中两个是嘌呤（purine）的衍生物： 腺嘌呤（Adenine, A）和鸟嘌呤（Guanine, G）；三个是嘧啶（pyrimidine）的衍生物：胞嘧啶 （Cytosine, C）、胸腺嘧啶（Thymine, T）和尿嘧啶（Uracil, U）。6DNA中存在四种碱基： 腺嘌呤(A)，鸟嘌呤 (G)，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)RNA中存在四种碱基： 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)

4、和尿嘧啶(U)7 脱氧核糖(或核糖)中C1上的半缩醛羟基(-构型)与嘌呤碱基的N9-H或嘧啶碱基的Nl-H脱水生成 C-N糖苷键，形成相应的核苷(nucleoside)。核苷8 磷酸和核苷酸：核苷的核糖C5上的羟基与磷酸所形成的磷酸酯，称为核苷酸(nucleotide)。核苷酸是构成核酸(DNA和RNA)的结构单元分子。核苷酸92. 多聚核苷酸 通过核苷酸的磷酸基与另一分子核苷酸的核糖 C3上的羟基形成磷酸二酯桥相连而成的长链结构化合物多聚核苷酸，即DNA或RNA（见图3-1）。 多聚核苷酸链具有如下特点： 多聚核苷酸是通过5-3磷酸二酯键连接而成。链的一端一般含有一个游离的5-磷酸基，另一端

5、则有一个游离的3-羟基。多聚核苷酸链具有方向性，必须注明(如53或35)。1011 多聚核苷酸是由含有不同碱基的核苷酸组成。因此具有一定的核苷酸顺序，即核酸的碱基顺序。核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。核酸的碱基顺序具有极其重要的生理意义。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息储存的分子形式。 多聚核苷酸的结构也可以简化为：腺嘌呤胞嘧啶鸟嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶12上述多聚核苷酸的核苷酸顺序可表示为： 5PAPCPGPTPT3如果仅仅只关心其中的碱基顺序，则可以写成： 5ACGTT3注意：上式所表示的核苷酸顺序是从左至右53。133. DNA 的结构 1953年，Watson J和Crick F在前人的研

6、究工作基础上，应用DNA结晶的X衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋(DNA double helix)结构模型，并对模型的生理意义作了科学的解释和预测。Watson和Crick的发现，是20世纪最伟大的科学成就之一。14 DNA分子的双螺旋结构：DNA双螺旋结构具有如下几个特点。 DNA分子由两条多聚核苷酸链组成。两条链沿着一个共同的轴平行盘绕，形成(右手)双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条DNA链方向为53, 而另一条链方向为35。 嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90。15 螺旋的横截面的直

7、径约为20。每条链相邻两个碱基之间轴距为3.4。每10个核苷酸形成一个螺旋。螺旋的螺距（即螺旋旋转一圈）高度为34。 两条多聚核苷酸链的盘绕力是链间的碱基对所形成的氢键，碱基对的形成有严格的配对规律：16 因此，在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。17 DNA的复制及其生理意义：Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构不久，就提出了著名的DNA复制(replication)机制假说，其要点是： DNA在复制过程中，组成双螺旋的两条DNA链先 拆分成两条单链； 以DNA单链为模板，合成与模板完全互补的新链，并形成一个新的DNA双螺旋分子。经过一个复制周期后，子代 DNA分

8、子的两条多聚核苷酸链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制(semiconservative replication)。18 DNA复制理论是生物基因遗传的最基本分子机制。1958年，科学家们用实验精确地证明了DNA复制理论的正确性。 DNA的三螺旋结构： 1957年，Rich A 等用两条多聚尿嘧啶核苷酸链(poly U)和一条多聚腺嘌呤核苷酸链(poly A)合成出一种三链结构的物质，并提出了DNA三螺旋结构(triple helix)的概念。近年来，对于DNA三螺旋结构和功能的研究已经取得了很大的进展，认为它在阻断基因转录和对 DNA进行“分子剪切”方面具有潜

9、在的应用价值，因而引起了广泛的关注。19 DNA的三螺旋与双螺旋相似，都是通过DNA单链之间形成氢键实现的。DNA三螺旋结构具有如下一些特点： 组成三螺旋的DNA单链，一般都是由单一的嘌呤碱基(A和G)或单一的嘧啶碱基(C和T)所组成。 DNA三螺旋的基本结构有两种。一种是由两条多聚嘧啶碱基核苷酸链和一条多聚嘌呤碱基核苷酸链组成，简单表示为：嘧啶-嘌呤-嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：T-A-T, C-G-C。20 第二种是由两条多聚嘌呤碱基核苷酸链和一条多聚嘧啶碱基核苷酸链组成，简单表示为：嘌呤-嘌呤-嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：A-A-T, G-G-C。上述两种结构中，中间的碱

10、基必须是嘌呤碱基。 每一条单链至少由8个核苷酸组成。 21 DNA三螺旋形成的条件是比较特殊的，因而在生物体内存在的可能性较小，但在实验室中则容易实现。目前，关于DNA三螺旋的生物学意义还只是一些预测，显然，在这方面进行深入的研究是很有意义的。224. RNA的结构和分类 RNA与DNA在结构上有明显的差异。除了核苷酸的组成不同外，更重要的是表现在立体结构上。 RNA是单链分子：RNA分子是单多聚核苷酸链。在RNA分子中，并不遵守碱基种类的比例关系，即RNA分子中嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基总数。在RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构。不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可形象地称

11、为“发夹型”(hairpin loops)结构，见图3-6。 23 RNA的双螺旋结构中碱基配对情况并不如DNA中严格。G除了可以和C配对以外（主要配对方式），也可以和U配对。但是G-U配对形成氢键能力较弱。注意：24 RNA的分类：RNA的基本功能是负责DNA遗传信息的传递、翻译和表达。根据RNA功能不同可以分为三类。 mRNA(messenger RNA, 信使RNA):mRNA约占细胞中RNA总量的5%。不同类型mRNA的链长差别很大。它的功能是将DNA遗传信息传递到蛋白质生物合成基地，并作为蛋白质生物合成的模板。25 tRNA(transfer RNA, 转移-RNA):tRNA约占R

12、NA总量的15%。它的特点是不同种类的tRNA虽然碱基顺序不同，但其大小和形状差别不大，链长平均约为75个核苷酸。tRNA的功能是将mRNA所携带的蛋白质氨基酸顺序信息翻译成相应的氨基酸，并将氨基酸以活化的形式运送到核糖核蛋白体合成蛋白质。因此，20种基本氨基酸，每一种最少有一个相应的tRNA。26 rRNA(ribosomal RNA, 核糖体-RNA): 它约占 RNA的80%, 是组成蛋白质合成基地核糖核蛋白体的主要成分。rRNA结构比较复杂，它的详细作用机制目前还不很清楚。273.3 核酸和生命遗传的化学本质 含氮碱基：嘌呤碱基和嘧啶碱基是核酸中最重要的组分。它们的性质和反应性能对于核

13、酸的性质和生理功能具有重要影响作用。 嘌呤碱基和嘧啶碱基都是高熔点(300以上)的无色晶体物质。在水中溶解度很小，当它们转变成核苷或核苷酸后，溶解度大大增加。它们都是弱碱性化合物。281. 碱基环的芳香性和互变异构 嘌呤碱基和嘧啶碱基的杂环体系具有芳香性，并且存在互变异构现象。2930 不同的异构体形成氢键的能力和方向也有明显差别（图中用箭头表示形成氢键的情况：表示氢给体，表示氢受体）。 碱基环互变异构的方向，主要取决于介质的条件，其中影响最大的是pH值和温度。由于不同的互变异构体形成氢键的能力和方向差异很大，因此对核酸的立体结构有很大的影响。312. 碱基的碱性 嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱

14、性。杂环上氨基的pKa值约为9.5。例如，尿嘧啶中N1或N3上质子离解的pKa值为9.5；腺嘌呤N9上质子离解的pKa值为9.8。32 碱基环上氨基的碱性可以从阴离子的共振稳定性和环上氮原子的sp2杂化来解释。环外的氨基（存在于A, G, C三种碱基中）的碱性很弱，在生理pH条件下不能质子化，这种情况与苯氨的氨基相似。因此嘌呤和嘧啶碱基的碱性主要是环上氨基的贡献。3. 嘌呤和嘧啶碱基的化学反应 含氮碱基的化学性质主要决定于氮原子的存在状态。33 亲电取代反应：在嘧啶环上含有两个氮原子，由于电子效应的结果，使C5上的电子云密度比其他碳原子高一些，因此对亲电取代反应最敏感。与此相似，嘌呤环中，C8

15、的电子云密度比C2和C6高 ，因此C8对亲电取代反应也最敏感。34嘌呤和嘧啶碱基可以发生多种亲电取代反应。主要的反应有： 尿嘧啶核苷的氯代：35 腺嘌呤核苷的溴代 生成的8-溴腺嘌呤核苷可以进一步转变成多种腺苷衍生物：36 尿嘧啶核苷转变成胸腺嘧啶核苷： 5-甲基胞嘧啶的生物合成：RNA或DNA中的胞嘧啶，在甲基化酶(methylase)的作用下，能与SAM作用，转变成5-甲基胞嘧啶。37 亲核-加成消除反应：碱基的含氮杂环中各个原子上的电子云密度分布是不均匀的，在一定条件下也可以发生亲核加成反应。 水解反应：含有羰基的碱基(G,C,T,U), 从结构上看具有酰胺键特点。因此在碱性条下，能发生

16、水解开环反应：S-腺苷甲硫氨酸38腺嘌呤碱基不含羰基，因此对碱比较稳定。 与肼的反应：嘧啶碱基能与肼作用，得到两种不同的产物： 39此反应只发生在嘧啶碱基，而嘌呤碱基不能发生这类反应，因此在核酸分析中有重要的应用价值。与羟胺的反应：嘧啶碱基能与羟胺反应，环外的 氨基也会受到影响。40尿嘧啶核苷与羟胺在pH=910条件下反应时，将发生碱基开环分解反应： 41 氨基的烷基化反应：在一般烷基化反应条件下，含氮碱基的烷基化反应主要发生在杂环的氮原子上，不同的烷基化剂，烷基化产物也有所不同。以上烷基化反应活性顺序是 G A C。在此条件下，U和T基本上不起反应。典型的烷基化产物如下:42 在温和的碱性条

17、件下，1-甲基腺嘌呤核苷可以发生Fischer-Dimoth重排，得到环外氨基的甲基化产物：43 用CH2N2做烷基化剂，则所有含氮碱基都能发生烷基化反应，反应活性顺序是：UT G C A。 环外氨基的反应：环外的氨基虽然不活泼，但在适当条件下，也可以发生化学反应。胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变成尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。44 腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别生成次黄嘌呤核苷（inosine）和黄嘌呤核苷 （xanthosine）。这种碱基的变化，将影响或改变形成氢键的能力和方向，导致DNA复制错误，是引起基因突变的重要原因

18、之一。45 光聚合反应：胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以 发生二聚加成反应： 在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，即可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了DNA分子复制功能。46 环外氧原子的烷基化反应：鸟嘌呤6位上的羰基可以异构化成烯醇式异构体。因此在一定的条件下可以发生烷基化反应。DNA用甲基化剂处理，可以得到6-甲氧基鸟嘌呤。甲基化的鸟嘌呤不再与胞嘧啶配对，而与胸腺嘧啶配对。正常情况与胞嘧啶配对烷基化后与胸腺嘧啶配对47常用的烷基化剂主要有： 含氮碱基的紫外吸收光谱：嘌呤碱基和嘧啶碱基中都存在有-电子共轭的杂环体系。因此在紫外区都有特征吸收峰。核酸的UV最大吸收约为2

19、60nm，利用这一性质可以和蛋白质区别开来（蛋白质的UV最大吸收峰为280nm左右）。483.4 核酸的性质1. 核酸的离解性质 多聚核苷酸链中含有两类可离解的基团。 多聚核苷酸链的离解性质与多肽链情况相似，能够发生两性离解，也有等电点。由于磷酸是一个中等强度的酸，而含氮碱基碱性很弱，因此核酸的等电点都在低pH值范围内。DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。DNA和RNA等电点相差较大这一特点 ，在DNA和RNA分离中具有重要意义。49 DNA和RNA等电点相差较大的原因，很容易从它 们的结构特点来理解。RNA链中，核糖2 -OH的氢原子能与磷酸酯中的羟基氧原子形成氢键，促进了磷

20、酸酯羟基中氢原子的离解。2. 核酸的水解 酸或碱水解：多聚核苷酸链在适当的条件下能被酸或碱水解成核苷酸。但是DNA和RNA对酸或碱的稳定性有很大的差别。例如，在室温条件下，用 0.1 mol/L NaOH溶液即可将RNA完全水解，得到2-或 3-磷酸核苷的混合物。 50 在相同条件下，DNA则不受影响，说明DNA比 RNA要稳定得多。这是因为，RNA分子中核糖2-OH的存在促进了磷酸酯键的水解过程。DNA和RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。51 DNA作为遗传信息的携带者，要求具有一定的稳定性，而RNA 在大多数情况下是作为DNA的信使，完成任务后即分解掉，所以要求RNA具有易被

21、水解的特性。 酶水解：在生物体内存在着多种核酸水解酶 (nuclease)。这些酶可以水解多聚核苷酸中的磷酸二酯键。核酸水解酶一般可分为RNA水解酶(RNases)和DNA水解酶(DNases)。核酸水解酶还可以根据其水解核酸方式分为两类： 核酸外切酶 (exonucleases): 能够从多聚核苷酸链的一端(3-端或5 -端 ) 开始，逐步将核苷酸水解下来。52 核苷酸内切酶(endonucleases):能够水解多聚核苷酸链中某种核苷酸形成的磷酸酯键。不同的核酸水解酶的水解产物核苷酸也不同，可以是5-单磷酸核苷或 3-单磷酸核苷。 最有意义的核酸水解酶是限制性核酸内切酶 (res- tri

22、ction endonucleases)。它可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。因此在核酸分子结构研究、基因重组技术等方面具有重要价值。下面是几种DNA 限制性内切酶水解DNA的例子。这些内切酶能够识别并水解某些具有对称因素的碱基顺序的部位。5354 核酸水解酶催化水解的机制比较复杂。目前研究得比较清楚的是牛胰腺核糖核酸酶A(bovine pancreatic ribonuclease A, 简称RNase A)。它能水解RNA链中含嘧啶碱基的核苷酸与含嘌呤碱基核苷酸之间形成的磷酸酯键，得到3-单磷酸核苷。水解反应机制见图4-7。553.5 核酸碱基顺序分析中的化学反应 1. Maxa

23、m-Gilbert碱基顺序分析法 核酸的碱基顺序分析是核酸化学和分子生物学的重要基础之一。1975年，Maxam A和Gilbert W发展了一种核酸碱基顺序快速分析方法。这种方法的基本原理是应用有机化学方法，选择性地切断某种特定核苷酸(A, G, C, T)所形成的磷酸酯键。所以此法又称为化学降解法(chemical cleavage method)。56 嘌呤碱残基的选择性水解：核酸中的嘌呤碱基和嘧啶碱基可以与硫酸二甲酯作用，但反应条件及甲基化产物的性质不同。在温和的条件下，用硫酸二甲酯处理DNA, 分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷(N3-methyladenine)

24、和N7-甲基鸟嘌呤核苷(N7-methy1guanine)。57 不同碱基的甲基化产物对于水解去嘌呤碱基反应敏感程度有明显差别。N7-甲基鸟嘌呤核苷在中性条件下即能发生脱嘌呤碱基反应，而N3-甲基腺嘌呤核苷则应在酸性条件下才能发生脱嘌呤碱基反应。脱去了嘌呤碱基的核糖磷酸酯键，在0.1mol/L NaOH碱性条件下可以被水解切断。在此条件下，其余的磷酸酯键不受影响。5859 嘧啶碱残基的选择性水解：DNA链用肼处理，其中的嘧啶碱残基被脱去，生成核糖腙衍生物，再在哌啶(piperidine)存在下水解，核糖腙3-位的磷酸酯键则被水解断裂。6061 根据上面反应原理，可以在不同反应条件下，选择性地切

25、断分别由四种不同的核苷酸形成的磷酸酯键。注意：不论嘌呤碱基或嘧啶碱基，在选择性水解后，在水解位点上的含氮碱基都消失了。 例如一个多聚核苷酸链5-ATTGACTTAGCC-3, 在一定条件下，在G处切断（伴随鸟嘌呤碱基脱去 ），则有以下几种情况可能发生：62由此可见，一共可以得到6种不同的多聚核苷酸片断（包括一条原来的DNA链）。它们可以用凝胶电泳(electroph -oresis)方法分离图3-11(a)。63 但是在实际上，这种电泳图谱还是很难解析。为了解决这个问题，Maxam和Gilbert找到了一个很好的解决办法。在多聚核苷酸激酶作用下，将放射性同位素32p标记到多聚核苷酸链的5-端上

26、：32P-ATTGACTTAGCC。这样，用上述方法在 G 处切断后得到的 6 个片断中，有三个含有32p的标记物，即32P-ATT, 32P-ATTGACTTA和32P-ATTGACTTAGCC。用放射显影方法很容易识别图3-11(b)。多聚核苷酸片断的长度与它在凝胶电泳中移动的速率成反比。64 因此，根据图3-11(b) ，很容易得出 G在多聚核苷酸链中所处的位置为第4和第10。再分别在A, C和T处切断，即可将A, G, C, T在多聚核苷酸链中位置全部确定。Maxam-Gilbert碱基顺序分析法主要过程如图3-12所示。6566672. Sanger碱基顺序分析法 1976年，Sanger F发展了一种新的核酸碱基顺序分析法