植物病原细菌的分离_第1页
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文档简介

1、植物病原细菌的分离、纯化及鉴定1实验目的及意义植物病原菌的分离、鉴定是植物病理学实验最基本的操作技术之一，通过本 实验，要求掌握植物病原菌分离培养、纯化鉴定的一般原则和方法。2实验材料及准备2.1实验材料：新发病的植物组织2.2培养基准备 （LB培养基）：胰蛋白月东1%，NaCl 1%，酵母浸粉0.5%， pH7.0-7.2, 121C灭菌 20 min，备用。2.3实验用具：载玻片、盖玻片、酒精灯，手术剪，镊子，培养皿9cm）， 斜面培养基，灭菌水，1% NaClO，打火机。3实验方法及步骤3.1植物样品的采集选取发病初期植株，样本尽量保持完整，至少包含病健交界处；将样品放入 纸袋保存或邮寄

2、，并做好记录；需要分离的标本应尽快完成分离工作（1-5d）， 长期保存需压干，未压干的标本勿装塑料袋。3.2发病组织的显微检查准备好洁净的载玻片、盖玻片和水；取小的整块标本洗净、晾干/吸干；切 取约2x4mm大小病健交界组织；从上述组织中切取尽可能薄的小片平放在载玻 片上；加一滴水，盖好盖玻片，防止气泡；先用低倍镜（4x，10 x）检查，看到白 色、半透明、雾状的喷菌现象；换用40倍物镜观察，看到杆状、透明、活动的 菌体，证明的确为细菌性病害。3.3病原物的分离和培养选取镜检有喷菌现象的组织进行划线分离：所取组织用自来水洗净，吸干； （以下进入超净工作台操作）将植物组织剪成1x4mm的大小，1

3、%的次氯酸钠消 毒2-10min，灭菌水洗2-3次；将组织从病斑处剪碎放入约0.5-1ml水中，并让组织碎块在水中浸泡5-15min,让细菌释放到灭菌水中；取病汁液1-3环，在LB 平板上划线28C温箱中培养，每天观察菌落生长情况并记录：菌落长出的时间、 菌落大小、颜色、形态。3.4病原物的纯化和保存3-4 d后选取生长量较多且形态一致的菌落，LB平板上划线纯化。若仍然生 长不纯，则需多次纯化。划菌采用三线法。挑取纯化后的单菌落移入斜面生长， 每菌移3管。24小时后从斜面上再次转移菌体，并且保存该病原菌。k汁段到践法3.5病原物的鉴定利用基因组提取试剂盒提取细菌基因组，用通用引物将细菌16S

4、rDNA序列 扩增出来，长度1.5k左右。16S rNDA 通用引物：U8-27 (F) 5-AGAGTTTGA TC(AC)TGGCTCAG-3；L1494-1514 (R) 5-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC3。25ul 的反应体系：Buffer2.5 ulMg2+(25M)3.75ul TOC o 1-5 h z dNTP2ulrTaq0.5ulprimer10.6ulprimer20.6ulDNA1ulddH2O14.05ul25ulTotalPCR反应条件：94 C5min94 C1 min 56 C 1min a 30cycle72 C2 min 72 C 10 min12 C foever将PCR产物送测序公司进行测序，然后将序列送至基因库中进行比

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