红曲代谢产物Monascin制备及其抗肿瘤作用研究

1、红曲代谢产物Monascin制备及其抗肿瘤作用研究2课题背景及立论依据红曲霉菌我省最具特色的微生物资源，经固、液态发酵产红曲红曲可用于酿酒、制醋，可作为食品染色剂和调味剂，含有多种活性代谢产物，作为中药红曲产品主要有发酵用红曲、功能性红曲和色素添加剂，其中色素红曲、红曲红和红曲黄色素等占红曲产业链总产值的80%以上红曲霉菌主要代谢产物红曲色素、Monacolin 类化合物、-氨基丁酸、桔霉素等3课题背景及立论依据 红曲色素红曲霉菌次级代谢产物混合色素,醇溶性红曲色素6种，水溶性4种醇溶性色素主要分为红、橙、黄色素3类，每类色素各含两种色素单体4课题背景及立论依据红曲色素生理活性抗菌、降胆固醇、

2、抗阿尔兹海默症、抗癌Ankaflavin（Y2）对人肝癌细胞Hep G2具有细胞毒性，IC50值约为15 g/ml，而在同样浓度下，对正常细胞系MRC-5和WI-38却几乎没有细胞毒性。形态学变化研究和流式细胞术检测周期分布，发现有染色体皱缩及碎片，并有明显的G1亚峰口服Monascin （Y1）可以抑制过氧化亚硝酸盐或紫外线诱导的皮肤癌Rubropunctatin （O1）对人神经瘤细胞SH-SY5Y、人胃癌细胞BGC-823、AGS和MNK45均具有显著的增殖抑制作用，而对人正常胃粘膜上皮细胞GES-1则无细胞毒作用高纯度红曲色素具有成为新型抗癌药物的潜力5课题背景及立论依据细胞凋亡与细胞

3、分化细胞凋亡程序性细胞死亡，主要有线粒体路径和死亡受体路径诱导分化恶性肿瘤细胞在体外分化诱导剂的作用下，向正常细胞方向分化逆转的现象。 典型事例：全反式维甲酸（ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病研究热点从天然资源（包括动植物、微生物等）中分离得到高纯度的组分，并评价其抗癌活性和探索作用机理6实验路线高纯度红曲色素单体的制备红、橙、黄3组红曲色素抗肿瘤作用初筛(MTT实验)红曲色素单体对肿瘤细胞生长抑制作用机制探索对人胃癌细胞AGS生长抑制作用机理探索对人恶性黑色素瘤细胞A375生长抑制作用机理探索71 高纯度红曲色素提取分离乙醇萃取-高速逆流色谱法分离-结晶组合技术水提 30%醇提 70%醇提

4、70%醇提红（Red-1和Red-2）、橙（Orange-1和Orange-2）、黄（Yellow-1和Yellow-2）色素为主要成分的提取液 提取图1-1 HPLC-PAD检测醇溶性红曲色素组分81 高纯度红曲色素提取分离筛选出正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，制定了两步分离策略，实现了6种组分的分离纯化，纯度高于90.0% 高速逆流色谱法n-hexaneethyl acetate methanolwater (10:0:7.5:2.5, v/v/v/v)n-hexaneethyl acetate methanolwater (2.5:7.5:5:5, v/v/v/v)图1-2 高速逆流

5、萃取法分离醇溶性红曲色素91 高纯度红曲色素提取分离采用热饱和溶液法，获得块状（红）、针状（橙）、片状（黄）晶体，纯度大于98.5% 结晶法图1-3 6种红曲色素样品的检测102 红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响A375A431PC-3AGS2.1 MTT初筛（红、橙、黄3组色素，24、48h）112 红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响红曲色素对4种细胞系的IC50（mol/L）groupsTime（h）Cell lines恶性黑色素瘤A375表皮鳞癌细胞A431前列腺癌细胞PC-3胃癌细胞AGS红（R1+R2）24181.6251.5 147.3 121.3 48128.26 170.8 13

6、1.144.8橙（O1+O2）241051.5 806.9 985.4 723.3 482705.7 332.2 704.0 198.3 黄（Y1+Y2）24138.46146.6 108.9 27.3 4868.1 148.6 74.8 19.5 Taxol2417.115.6488.94.02.1 MTT初筛122 红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响结论：Monascin对正常组织细胞的抑制作用不及紫杉醇，其毒副作用较小，具有一定的安全性。图2-1 Monascin和紫杉醇对胃粘膜上皮细胞GES-1细胞生长的影响（24 h）2.2 MTT 实验检测细胞毒副作用133 Monascin对AGS

7、生长抑制作用机制研究control10mol/L80mol/L40mol/L 细胞核形态观察均匀浓集皱缩碎裂图2-2 Hoechst 33258染色观察细胞核形态（24 h）143 Monascin对AGS生长抑制作用机制研究剂量(mol/L)G0/G1SG2/MSub-G0/G1044.3534.5721.081.991041.0233.2825.701.622039.7530.2230.037.434043.7225.1431.1517.808043.6626.2830.0530.01处理时间G0/G1SG2/MSub-G0/G11252.2029.1318.674.892439.7530

8、.2230.037.433627.4144.8327.7626.274837.7646.9615.2937.003.2 流式细胞仪检测细胞周期分布153 Monascin对AGS生长抑制作用机制研究controlMonascin(20mol/L)Monascin(40mol/L)Monascin(10mol/L)Taxol(10mol/L)Taxol(20mol/L)3.3 Annexin V/PI 检测细胞凋亡M1M2M3M4163 Monascin对AGS生长抑制作用机制研究1、control 2、20mol/L 3、40mol/L 4、80mol/LMonascin可能通过抑制Survi

9、vin表达，诱导AGS发生凋亡3.4 Survivin与Bcl-2含量检测173 Monascin对AGS生长抑制作用机制研究随着Monascin浓度的升高，Caspase-3酶活力显著提高；50 mol/L作用24 h后，其酶活力是control组的倍。随着时间的延长，酶活力也显著增长。3.5 Caspase-3活性检测184 Monascin对A375生长抑制作用机制研究 control 20mol/L 40mol/L60mol/L 80mol/L 100mol/L 细胞核形态观察细胞核基本呈淡蓝色均匀分布状194 Monascin对A375生长抑制作用机制研究S期和G2/M期细胞的比例显

10、著下降，G0/G1期细胞比例显著升高。48h后，90.4%的细胞被阻滞在G0/G1期，而未见明显的亚二倍体峰Control 6h 12h 18h 24h 48h53.9%90.4% 流式细胞仪检测细胞周期分布204 Monascin对A375生长抑制作用机制研究Monascin处理的A375细胞中黑色素含量显著增大Groups（molL-1）melanin content（per 106cells）倍数control0.4730.006 1.00 200.3950.0020.84 400.6670.0081.41 601.1240.0142.38 801.5440.0223.26 A375细胞

11、黑色素含量变化214 Monascin对A375生长抑制作用机制研究Groups（molL-1）total activity of tyrosinas倍数control0.0280.0021.00 200.0300.007 1.07 400.0460.0061.64 600.0730.0102.61 800.1020.0133.64 Monascin处理的A375细胞中酪氨酸酶的总酶活力显著增大 A375细胞酪氨酸酶活性的变化224 Monascin对A375生长抑制作用机制研究经Monascin诱导后，出现细胞核缩小、胞浆比例增大、细胞器增多等典型的分化现象。 A：Control（12000

12、）；B：20mol/L（12000）；C：60mol/L（12000） 透射电镜观察细胞超微结构234 Monascin对A375生长抑制作用机制研究相对表达量 1 0.5 0.18 0 -actin(43kDa)P53(53kDa)A: control B: 20mol/L C: 40mol/L D: 80mol/LMonascin对A375细胞的诱导分化作用，与细胞中p53基因调控有关4.6 P53蛋白含量检测244 Monascin对A375生长抑制作用机制研究Monascin可抑制A375的体外运动能力。当浓度为60 mol/L时，穿膜的细胞数仅为control组的40% 对A375细

13、胞迁移的影响25结论1. 红曲霉菌Monascus sp. Strain FZK经过固态发酵、乙醇提取、高速逆流萃取技术和结晶方法，得到6种高纯度色素组分。HPLC-MS及核磁共振鉴定，6种色素成分分别为红曲素Monascin、红曲黄素Ankaflavin、红斑红曲素Rubropunctatin、红曲玉红素Monascorubrin、红曲玉红胺Rubropunctatamine和红斑红曲胺Monascorubramine。2.通过MTT法检测红色素、橙色素和黄色素对AGS、PC-3、A375、A431四种肿瘤细胞生长的影响。结果显示，红色素和黄色素对4株肿瘤细胞均有一定的增殖抑制作用。黄色素对

14、AGS的增殖抑制作用最为显著，其24、48、72 h的IC50分别为、 mol/L。黄色素对A375的增殖抑制作用居第二，其24、48、72 h的IC50分别为、70.7 mol/L。26结论3.Monascin对AGS增殖的抑制作用通过诱导凋亡实现，国内外未见相关报道Hoechst 33258染色细胞核出现皱缩、碎裂和凋亡小体等典型凋亡特征细胞周期分布检测，表明Monascin处理的AGS细胞出现G2/M期阻滞现象，随时间浓度升高，亚二倍体峰比例增大Annexin V/PI检测结果表明，AGS细胞经Monascin处理后凋亡细胞的比例递增蛋白免疫印迹检测Monascin作用后AGS细胞中Survivin蛋白表达量显著下降，而Bcl-2蛋白表达量未见明显变化Caspase 3酶活力显著升高提示Monascin通过下调AGS细胞中凋亡抑制蛋白Survivin的表达，激活细胞Caspase家族蛋白，促进细胞凋亡27结论4.Monascin对A375增殖的抑制作用通过诱导分化实现，国内外未见相关报道Hoechst 33258染色和细胞周期分布检测结果表明Monascin处理的A375细胞出现G0/G1期阻滞现象，随时间浓度升高，其比例增大，未见亚二倍体峰比例显著升高检测Monascin处理的A375细胞