抗黄曲霉毒素M1抗体制备及检测方法建立

1、抗黄曲霉毒素M1抗体制备及检测要领创立【关键词】黄曲霉毒素1；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验摘要：目的制备针对黄曲霉毒素1的单克隆抗体并创立针对黄曲霉毒素1的间接竞争酶联免疫吸附试验检测要领。要领利用B细胞杂交瘤技能，创立能排泄抗黄曲霉毒素1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备抗黄曲霉毒素1单克隆抗体，创立间接竞争酶联免疫吸附试验检测要领。效果研制出1株能特异性排泄抗黄曲霉毒素1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，定名为2F2。该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1，亲和常数为2810-11l/L。该抗体与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素2等布局雷同物有薄弱的交织反响，具有较

2、高的特异性。在此底子上创立了间接竞争酶联免疫吸附试验检测要领。该要领的最低检出浓度为007ng/l，校正曲线的线性范畴为0022ng/l，线性方程y=-04364x+02693(R2=09949)。要领的加标接纳率为725%1313%。结论制备了具有高特异性和亲和力的抗黄曲霉毒素1单克隆抗体，并创立了快速、敏捷的针对黄曲霉毒素1的酶联免疫吸附试验检测要领。关键词：黄曲霉毒素1；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验Keyrds：aflatxin1;nlnalantibdy;enzye-linkediunsrbetassay黄曲霉毒素1(aflatxin1,AF1)是动物摄入黄曲霉毒素B1(AFB1)后在

3、体内经羟基化代谢的产物，存在于动物体内可食部门，如乳、肝、蛋类等，此中以乳最为常见，且乳与乳成品中的AF1在消费和贮藏期间相对不变，巴氏消毒难以粉碎1。AF1的急性毒性与AFB1大抵雷同，可引起实行动物产生肿瘤2，50g/(kgb)的AF1可致大鼠肝癌及结肠腺癌3，别的尚有AF1引起牙原性肿瘤的报道4。鉴于AF1对人类康健组成埋伏的威胁，在我国食用乳与乳成品者又多为婴幼儿、老年人和体弱多病者，因此，必需对其含量举行监控，限定AF1在牛奶或乳成品中的污染程度，到达庇护消耗者康健的目的。因此，创立正确、轻便、快速、敏捷、接纳率高、不需特别装备和可在下层实行室开展的检测阐发要领非常需要。本文旨在制备

4、抗黄曲霉毒素1单克隆抗体，并对抗体特性举行判断，为进一步研制具有我国自主知识产权的免疫学快速检测试剂盒提供技能支持。1质料与要领11质料111东西2造就箱(美国Queue公司)；清洁事情台(北京半导体装备一厂)；生物倒置显微镜(日本欧林巴斯光学株式会社)；酶标阐发仪(瑞士SUNRISE公司)；电子阐发天平(瑞士ettler公司)；低温高速离心机(德国Herle公司)；平凡离心机(北京医用离心机厂)；电泳仪(美国BIRAD公司)；微量可调移液器(法国Gilsn公司)；细胞造就板(96孔(美国star公司)；24孔(美国Gib公司)；酶标板(96孔，美国rning公司)。112试剂黄曲霉毒素1，黄

5、曲霉毒素1-BSA偶联物(AF1-BSA)、牛血明净卵白(BSA)、抗体亚类测定试剂盒(Ig,IgG,IgA,IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3)、黄曲霉毒素B1(AflatxinB1)、黄曲霉毒素B2(AflatxinB2)、黄曲霉毒素G1(AflatxinG1)和黄曲霉毒素G2(AflatxinG2)(美国Siga公司)。RPI1640造就基，选择性造就基，福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DS)，3,3,5,5四甲基联苯氨(TB)、吐温20(Teen20)、聚乙二醇(PEG，4000)、青霉素、链霉素(美国Gib公司)；辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山试剂公司)；

6、30%H22(优级纯，北京化工场)；二甲基甲酰胺、过碘酸钠、酸楚、硼氢化钠、无水乙醇、乙醚、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、氢氧化铵、硫酸铵、氢氧化钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠等，均为阐发纯以上(北京化学试剂市肆)。113溶液体系参考文献5制备。114细胞系与实行动物小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由本室传代，并经8氮杂鸟嘌呤处置惩罚。雌性BALB/小鼠，体重1820g(军事医学科学院实行动物研究所动物繁育场)。12要领121免疫动物接纳小剂量长周期的免疫方案。对68周龄的雌性BALB/小鼠，体重1820g，初次免疫用100g黄曲霉毒素1-小牛血明净卵白(BSA)与等

7、量完全福氏佐剂混匀，腹腔注射。2周后，用50g黄曲霉毒素1-BSA与等量不完全福氏佐剂混匀后，腹腔注射。今后每隔2周用50g黄曲霉毒素1-BSA与等量不完全福氏佐剂混匀，腹腔注射。8周后脾内免疫50g黄曲霉毒素1-BSA作为增强免疫，3d后取脾细胞举行交融。122细胞交融免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)以101混淆，用50%聚乙二醇(PEG)作交融剂。交融细胞悬于含20%小牛血清的选择造就基内，分种于加有BALB/小鼠腹腔排泄细胞作滋养层的96孔细胞造就板中，置5%2,37孵箱中造就，当镜检杂交瘤克隆生长达1/31/2视野时，取上清举行筛眩123杂交瘤挑选及抗体检测以黄曲霉毒素1-

8、BSA为包被抗原，用间接非竞争ELISA法挑选排泄抗黄曲霉毒素1抗体的细胞孔，用黄曲霉毒素1间接竞争按捺性ELISA法确证。以免疫小鼠的血清为阳性比较，以Sp2/0细胞造就的上清液为空缺比较，以细胞造就板中未长出克隆的细胞造就上清为阴性比较，阳性细胞孔的判断尺度为(A试验-A空缺)/(A比较-A空缺)21。124杂交瘤细胞克隆化接纳造就瓶内正确计数稀释法8。当一连3次100%阳性，即可将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中。125单克隆抗体的消费接纳动物体内诱生单克隆抗体的要领6。126单克隆抗体的纯化接纳饱和硫酸铵法对腹水举行纯化7。13单克隆抗体的判断抗体的免疫球卵白种别及亚类判断接纳抗体亚类测定试剂

9、盒举行测定。抗体IgG含量接纳二喹啉甲酸(BA)卵白测定试剂盒举行测定。抗体分子量接纳十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)法8。抗体滴度测定以黄曲霉毒素1-BSA为包被抗原，从110000开始将抗体举行倍比稀释，以Sp2/0细胞造就上清为阴性比较，用间接非竞争ELISA要领测定抗体滴度，以(A试验-A空缺)/(A比较-A空缺)21的最大稀释倍数为滴定尽头。抗体亲和力的测定接纳间接非竞争性ELISA法，即测定抗体的亲和常数9。抗体的特异性和抗体的敏捷度用间接竞争按捺性ELISA法举行测定，参试毒素为黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素2。14样品提取

10、根据国度尺度要领提炔10。15黄曲霉毒素1间接竞争按捺性酶联免疫吸附试验检测要领试验条件的最正确组适用棋盘滴定法确定。(1)用黄曲霉毒素1-牛血明净卵白毗连物(00625ng/l)包被酶标微孔板，每孔100l，4留宿；(2)酶标板参加差异浓度的黄曲霉毒素1尺度溶液或样品提取液和单克隆抗体溶液的混淆液100l(该混淆液为毒素尺度溶液或样品提取液与单克隆抗体溶液按11混淆，提早混淆好，4留宿)，371h；(3)酶标板参加辣根过氧化物酶标识表记标帜的羊抗鼠抗体，每孔100l，371h；(4)酶标板加底物溶液，每孔100l，3730in；(5)每孔参加停顿液50l，于450n处测定吸光度值(A)。(6

11、)盘算：黄曲霉毒素1含量(ng/g)=*V1*V2*X/(*V3)。式中：为酶标板上测得的黄曲霉毒素1浓度(ng/l)，根据尺度曲线求得；V1为样品提取液的总体积(l)；V2为定容样液的体积(l)；V3为取出的样品液的体积(l)；X为样品提取液的稀释倍数；为样品的重量(g)。2效果21单克隆抗体的制备用黄曲霉毒素1-BSA免疫BALB/小鼠得到了较好的免疫应答。细胞交融后，经间接非竞争ELISA要领挑选，并用间接竞争ELISA要领确证，从中选择出对黄曲霉毒素1毒素有强按捺而阳性比较孔较强的细胞株，经34次亚克隆，到达3次100%阳性，创立了1株不变排泄抗黄曲霉毒素1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，定

12、名为2F2。22单克隆抗体特性的判断抗黄曲霉毒素1抗体亚类是IgG1，相对分子量是150KD，抗体的亲和力常数是2810-11l/L。抗体与黄曲霉毒素B1的交织反响率是155%，抗体与黄曲霉毒素G1的交织反响率是39%，抗体与黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素2和牛血明净卵白的交织反响率均1%。23黄曲霉毒素1尺度品校正曲线用20%甲醇-磷酸盐缓冲液将黄曲霉毒素1配成差异浓度尺度利用液(0,001,002,005,010,020,050,100,200,500,1000ng/l)，将抗黄曲霉毒素1单克隆抗体根据1106稀释，用间接竞争按捺性酶联免疫吸附试验法测得校正曲线，线性范畴是00

13、22ng/l，线性方程是y=-04364x+02693(R2=09949)。最低检出浓度为007ng/l。24加标接纳试验从市场上购置鲜奶和奶粉，别离举行05g/kg和10g/kg加标接纳试验。对鲜奶样品的均匀加标接纳率别离为(112596)%和(877198)%，对奶粉的加标接纳率别离为(1197156)%和(1086147)%，对百般品的加标接纳率范畴为725%1313%。3讨论在本研究中所制备的抗黄曲霉毒素1单克隆抗体，对黄曲霉毒素1具有高敏捷度和高特异性，可用于创立检测乳与乳成品中AF1污染程度的免疫学检测要领，以期到达对种种奶成品开展大范围观察，相识我国奶和奶成品中黄曲霉毒素的污染程

14、度。关于抗体的特异性，本研究选择了黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素2和牛血明净卵白举行交织反响。由于黄曲霉毒素在天然界中有很多衍生物，其布局极其相似，创立在多克隆抗体底子上的AF1检测要领多与其他黄曲霉毒素产生交织反响，而使其应用代价低落11。本研究在对抗黄曲霉毒素1杂交瘤细胞株大量挑选的底子上，得到了1株能排泄抗AF1的杂交瘤细胞株2F2，用该细胞株消费的抗体仅与黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素G1有薄弱的交织反响，与其他黄曲霉毒素的衍生物和牛血明净卵白无交织反响。由于黄曲霉毒素1是污染奶和奶成品的重要组分，因此，接纳2F2抗体创立的ELISA要领可以确保

15、对黄曲霉毒素1具有高度的特异性，不会影响黄曲霉毒素1ELISA试剂盒的现实应用。本研究乐成地挑选出可以或许排泄抗黄曲霉毒素1的单克隆抗体杂交瘤细胞株，制备出对黄曲霉毒素1具有高亲协力、高特异性的单克隆抗体，并创立了快速、敏捷的检测鲜奶及奶粉中黄曲霉毒素1污染程度的酶联免疫吸附试验检测要领，为鲜奶及奶粉的快速筛检提供了技能支持。参考文献1DPHEish,ullenJ,HsiehLS,etal.anerriskspsedbyaflatxin1J.PrinessTakaatsuSyp，1985,16:57-65.2usuanV,staGB,TrifilettiR,etal.Funtinalipair

16、entfratKupfferellsinduedbyaflatxinBanditsetablitesJ.FES-Iunlgialedi-Irbilgy,1995,10(2):151-155.3YshizaaT,YaashitaA,LuY.FunisinurreneinrnfrhighandlriskareasfrhuanesphagealanerinhinaJ.ApplEnvirnirbil,1994,60(5):1626-1629.4SydenhaE,ThielPG,arasasF,etal.NaturalurrenefsefusariuytxinsinrnfrlandhighesphagealanerprevaleneareasfTranskei,SuthernAfriaJ.JAgriFdhe,1990,38(10)：1900-1903.5江涛，李凤琴，王环宇,等.赭曲霉毒素A免疫学检测要领的研究J.中国群众卫生,2022，20(5)：556-558.6马世兴.正确快速的细胞克隆化试验研究J.单克隆抗体通讯，1993,9(2):70-72.7董志伟，王琰.抗体工程.2版，北京：北京医科大学出书社，2002：185-187.9万文徽.单克隆