壳聚糖羟基磷灰石支架修复骨软骨缺损的实验研究

1、壳聚糖/羟基磷灰石支架修复骨软骨缺损的实行研究王文良张华亮关静，初殿伟【摘要】目的探究双层壳聚糖hitsanS/羟基磷灰石复合支架(hydrxyapatiteHA)修复兔骨软骨缺损的可行性。要领接纳冻干法和烧结法制作双层壳聚糖S/羟基磷灰石HA复合支架，以骨髓间充质干细胞为种子细胞，运用纤维卵白胶莳植技能，以双层壳聚糖S/羟基磷灰石HA复合支架为载体，修复骨软骨缺损，实行分3组，A组：BS+支架，B组：单纯支架，组：未处置惩罚。将修复质料植入骨软骨缺损模子，别离于6、12周取材，举行大要不雅察，构造学检测，改进akitani法评分，经统计学处置惩罚，比力各组修复结果差异P0.05。结果1S/H

2、A支架S层孔隙率为76%5.01%，孔径为200400,均匀为300摆布，孔相通性好，HA层孔隙率为72%4.23%，孔径为200500,均匀为350摆布，孔相通性好，结合部结合好；2P2骨髓间充质干细胞较纯，扫描电镜不雅察Ss附着在复合支架上。大要不雅察和构造学检测表现，A组根本修复软骨缺损，骨缺损有骨小梁长入。B、组骨软骨缺损修复不良，构造学检测以纤维性构造或无新生构造形成，软骨及骨缺损均显着存在，改进akitani评分表现A组在6周、12周2个时间点的各项评分结果，均优于B、组，且差异有统计学意义(P0.05)。结论双层壳聚糖S/羟基磷灰石HA复合支架可作为骨软骨构造工程支架，结合BS可

3、修复软骨与骨的缺损，重修枢纽的剖解布局和成效。【关键词】壳聚糖/羟基磷灰石复合支架;构造工程;骨髓间充质干细胞;骨软骨缺损Keyrds：hitsan/hydrxyapatitebilayeredsaffld;stehndraltissueengineering(TE)；bneesenhyalsteells(BS);bnedefet如今软骨损伤生物学修复的金尺度是自体软骨移植。只管临床研究结果证明自体软骨移植大多数病例获得了很好的疗效，但生物学和临床上所面对的挑衅是损伤软骨的完全修复和成效重修。如今仍有两个重要的题目必要器重：1有研究表白由于外伤，病理改变和因年事等因素相干的枢纽软骨病变多陪同着

4、软骨下骨的病变，而软骨下骨病变，又可以影响其上软骨的新陈代谢，形成恶性循环，加重软骨病变乃至生长为骨性枢纽炎，影响软骨的恒久修复结果1、2；2新生的修复构造与四周宿主骨与软骨构造的彼此整合的题目，即新生构造与宿主四周的骨软骨缺乏安稳的锚定3，如今大多数软骨构造工程并没有办理这个题目。为了办理这两个题目，本实行接纳模拟枢纽骨软骨构造学布局的S/HA支架，结合兔骨髓间充质干细胞，同时修复免膝枢纽骨软骨缺损模子。1质料与要领1.1动物及重要试剂图1S/HA支架的宏不雅布局1.2实行要领称取S溶于醋酸配成浓度为3%(/v)壳聚糖溶液,同时参加聚乙二醇，离心去除气泡。将HA支架先放入的模具中，取配好的壳

5、聚糖溶液，倒入模具中成形，放入冰箱冷冻，在冷冻抽干机中冻干，制成壳聚糖/羟基磷灰石复合支架，中和支架内的醋酸溶液，重复PBS液冲洗，至pH值中性。别离用傅立叶红外光谱仪测定质料性子；乙醇交换法丈量其孔隙率4，扫描电镜不雅察复合支架孔径的巨细及内部布局。将支架泡入75%的酒精30in，紫外线照耀30in消毒。网络兔自体P2代骨髓间充质干细胞D1，调解细胞密度为2107/l，按文献4运用纤维卵白胶莳植技能体外构建细胞-支架复合体，将支架细胞复合物移入37、5%2及饱和湿度条件下孵育4h，再迟钝地参加细胞造就液中。再在37、体积分数为5%的2及饱和湿度条件下孵育10h，预备植入兔膝枢纽骨软骨缺损模子

6、内。戊二醛结实支架细胞复合体，扫描电镜SE不雅察细胞在支架上生长的环境。兔膝枢纽骨软骨缺损的制备及细胞-支架复合体的植入：36只日本大耳白兔，3个月龄巨细，体重20.2kg,取右膝枢纽，共36膝，随机分为3组，每组12膝，A组，复合支架+干细胞，B组，复合支架，组，未处置惩罚。肌肉注射速眠新0.2l/kg麻醉动物，通例消毒铺巾，依次切开膑韧带外侧缘，充实表露股骨下端外侧髁负重区，在其上做一个直径4，深度达3的圆柱形缺损，钻穿软骨下骨，扫除缺损内的血凝块后，置入细胞支架复合物或单纯支架或不作处置惩罚，无菌生理盐水冲洗枢纽腔，分层缝合。别离在6、12周取材，截取修复的股骨远端，4%多聚甲醛结实48

7、h，20%的EDTA钠盐脱钙3周、每周调换脱钙液2次，白腊包埋切片。不雅察指标为：术后一样平常环境，修复构造大要不雅察，HE染色及甲苯胺蓝染色等构造学不雅察。并按照改进的akitani评分法举行半定量评分5。接纳SPSS11.0统计软件包举行阐发，数据以均数尺度差表现，接纳方差阐发，SNK法举行两两比力，P0.05为有统计学意义。2结果2.1双层壳聚糖S/羟基磷灰石HA复合支架(图a)的理化性子检测2.2细胞支架复合物修复兔膝枢纽骨软骨缺损模子图6e、6、6a别离是空缺组、支架组、支架细胞组动物实行12周时软骨修复环境甲苯胺蓝，图7e、7、7a别离是空缺组、支架组、支架细胞组动物实行12周时软

8、骨修复环境甲苯胺蓝图6f、6d、6b别离是空缺组、支架组、支架细胞组动物实行6周时软骨下骨修复环境HE图7f、7d、7b别离是空缺组、支架组、支架细胞组动物实行12周时软骨修复环境HE，图中N指正常构造、R指修复构造、IF指接壤处。2.3S/HA支架复合体修复兔膝枢纽骨软骨缺损，改进akitani评分值A组优于B、组，且有统计学意义(表2。表2改进akitani评分值注：*A组与组比P0.05,*A组与B组比P0.053讨论3.1壳聚糖/羟基磷灰石支架作为骨软骨构造工程支架的可行性抱负的骨软骨构造工程支架质料应具有以下特性:(1)精良的生物相容性及生物宁静性；(2)三维立体布局孔隙率应到达90

9、%以上,并具有很大的内外貌积,孔隙直径均匀为150摆布;(3)精良的外貌活性，应可以或许促进骨软骨细胞粘赞同增殖;(4)生物可落解性，支架在构造形成历程中应渐渐被落解,而且不影响新天生构造的布局和成效;(5)可塑性，可被加工成所必要的外形并具有必然的机器强度,并使新形成的构造具有切合方案的外形;6质料泉源和代价具有商品化的远景6。壳聚糖是天然界普及存在的一种天然多糖类有机聚合物，它的分子布局和软骨基质糖氨多糖(GAG)布局相似，具有精良的生物相溶性和可落解性，对软骨细胞有较好的吸附作用，可促进细胞在质料上的增殖与分化7、8，是软骨构造工程中较相宜的支架质料。Nettles等9将猪软骨细胞接种于

10、冷冻枯燥法制备的壳聚糖多孔支架中,于旋转生物反响器中造就,经甲苯胺蓝及免疫构造化学检测,创造软骨细胞保持球形,并有大量卵白聚糖和型胶原排泄。羟基磷灰石是人体骨的重要无机质身分，不但能传导成骨，而且能与新骨形成骨键合，具有精良的生物相溶性。Brittberg等10以为HA含有的钙、磷身分在机体中可以产生略微的溶解,溶解的钙、磷与四周骨构造的钙离子、磷离子形成化学键11,与四周的软骨下骨的骨原细胞精细结合,随着时间的推移,骨原细胞渐渐进入支架,并向骨细胞演变,长入HA的微小孔隙中,并渐渐交换载体,规复软骨下骨的正常布局。在我们的实行中，双层壳聚糖/羟基磷灰石支架具有符合孔径和孔隙率。得当构造工程支

11、架要求，支架质料与细胞具有精良的相溶性，因此，壳聚糖/羟基磷灰石支架是骨软骨构造工程支架质料的抱负选择。3.2壳聚糖/羟基磷灰石支架的方案骨软骨构造工程旨在同时修复退变的骨软骨，是办理软骨退变的较抱负的措施。骨软骨构造工程支架要求有雷同于骨软骨构造学布局，即软骨样层和软骨下骨样层。Athanasiu等12最早提出“双相载体，雷同正常枢纽骨软骨的构造形态，疏松部门内部空间大，包容的细胞多，软骨前体细胞接种后在这种三维体造就中彼此作用，可形成枢纽面的软骨层。致密部门强度高，植入枢纽骨软骨缺损后可支持新形成的软骨构造，起到软骨下骨板的作用。他构建的“双相聚乳酸聚乙醇酸载体有相对致密的软骨下骨区和相对

12、疏松的软骨区。我们的实行表白，S模拟软骨样层，HA模拟软骨下骨层。结合自体骨髓间充质干细胞，软骨层得到了较好的修复，甲苯胺蓝异染性强，修复以透明软骨为主；软骨下骨层得到了部门修复，大概是时间不敷和HA落解慢的缘故原由造成的。但实行组优于比较组说明骨髓间充质干细胞复合在HA上是可以修复软骨下骨的。3.3体内微环境诱导支架细胞复合物修复骨软骨缺损。将骨髓间充质干细胞和支架复合体修复骨软骨缺损是必要必然的外界环境。外洋有学者将细胞支架复合体在体外环境下诱导成骨与软骨。auney将Ss复合在部门矿化的三维支架上，置于骨诱导液在动态生物反响器中造就，造就16d后碱性磷酸酶活性高于静态比较组，说明动态生物

13、反响器中应力刺激下有利于Ss向成骨标的目的分化13。hang方案了一种可以或许造就双相支架细胞复合物的双室生物反响器，用于同时体外构建软骨构造，体外造就4周后创造软骨细胞形成14。Ss向软骨及骨标的目的诱导分化是综合性因素。在体外难于完全模拟出符合的诱导环境，体内微环境是Ss诱导分化的天然环境，它包罗种种生物因子，理化刺激，力学环境等因素，因此有学者提出了体内生物反响器的观点，即要充实使用体内局部的如血运、种种理化因子刺激种子细胞等等来以更高的速率和更好的质量形成新的目的构造。Stevens用胫骨和骨膜制作了一个空间，使用此空间含有的富厚的间充质干细胞，用于自体内修复机制构造工程化新构造骨，用于对侧胫骨缺损的修复。本实行接纳冻干法，预先将S/HA支架毗连在