昆虫抗菌肽及其基因工程研究进展

1、昆虫抗菌肽及其基因工程研究盼望【摘要】昆虫抗菌肽是一类具有免疫效应的小分子多肽，它具有热不变、抗菌谱广、无免疫原性、作用机制奇特等特性，是昆虫可以或许抵抗天然界中有害微生物侵染的紧张因素。比年来，随着有关抗菌肽作用机理及成效研究的深化，其在医药范畴的研究越来越引起人们的存眷。本文就昆虫抗菌肽的分类、生物成效、基因工程研究盼望以及在医药范畴的应用等作一综述。【关键词】昆虫；抗菌肽；基因工程Abstrat：Insetantiirbialpeptideisakindfplypeptidehihhasthespeifiiunityfrbateria,fungi,virusandtherpathgeni

2、irrganiss.Ithassuhharatersasheat-durability,brad-spetruantibiti,niungenandspeifiehanis,eta1.Reently,insetantiirbialpeptidehasbeenidelyusedinthepreventinandtreatentfinfetiusdiseasesiththebakgrundandappliatinresearhnit.Thispaperbrieflyreviesitslassifiatinitsbilgialfuntins,thedevelpentngenetiengineerin

3、gandtheappliatininediine.Keyrds:inset;antiirbialpeptides;genetiengineering昆虫是天然界中最大的生物种群，现已确定并定名的约莫有80万余种，约莫占全部生物种类的55，除海洋外，别的险些全部的生态情况中都漫衍有种种百般的昆虫种群1。然而，国表里学者研究创造，昆虫没有和淋巴细胞，也无免疫球卵白，不具备高等动物那样高度埋头的得到性免疫体系。它们之以是可以或许在变化多端的天然界中占据极大的保存上风，是由于昆虫具有奇特而有用的无细胞免疫体系，当昆虫细胞被熏染后，其体内可以或许快速产生一种免疫诱导分子抗菌肽(antiirbialpep

4、tide)，对抗微生物的侵染。昆虫抗菌肽是昆虫特异基因编码产生的一类有免疫效应的小分子多肽，其氨基酸残基数量小于100，是昆虫体液免疫中最紧张的抗菌因子。它具有分子量孝热不变、抗菌谱广、无免疫原性、作用机制奇特、对高等动物正常细胞无害等特点。迄今已在昆虫中创造了凌驾200种抗菌肽类物质2，这些抗菌肽不但对细菌、真菌有广谱抗菌本领，对病毒、原虫及癌细胞也有必然作用。本文对昆虫抗菌肽的分类、特性和基因工程研究盼望作一综述。1昆虫抗菌肽的分类抗菌肽是昆虫免疫体系紧张的构成部门，昆虫藉此对细菌等病原菌有很强的对抗力。只管种种昆虫抗菌肽在巨细或氨基酸构成上不尽雷同，但是按照它们的序列和布局特性，可将昆虫

5、抗菌肽分为4类：以天蚕素(erpin)为代表的不含半胱氨酸残基的抗菌肽。天蚕素是第一种被创造的昆虫抗菌肽，普及存在于昆虫中，如今已经从鳞翅目的蛾类、蝴蝶及双翅目的蝇类中分散纯化出20多种天蚕素雷同物。以防范素(defensin)、殒命素(thanatin)为代表的富含半胱氨酸残基的碱性多肽。以膜翅目昆虫中创造的蜜蜂肽(apidaein)等为代表的富含脯氨酸残基的抗菌肽。以双翅目昆虫中分散得到的双翅肽(dipteriins)、打击素(attains)、麻蝇毒素(sartxins)等为代表的富含甘氨酸残基的抗菌肽3。2昆虫抗菌肽的生物学成效作为一种非特异性免疫分子，从昆虫免疫体系中分散出来的抗菌肽

6、在抵抗外来病原体侵染历程中起紧张作用。研究表白，昆虫抗菌肽不但对细菌有杀伤作用，对癌细胞、病毒、真菌、原虫也具有普及的杀灭活性。2.1抗细菌本领抗菌肽对很多致病菌包罗高度耐药性细菌菌株，如致病型大肠杆菌、硝酸盐杆菌、伤寒杆菌、金葡萄球菌等均有抗菌作用4。此中富含脯氨酸和甘氨酸的抗菌肽，假设蝇肽(drsin)、attain、dipteriin等对革兰氏阴性菌有较强杀伤作用；Defensin那么对革兰氏阳性菌较为敏感；而erpins以及2022年由izuiY等5从鳞翅目昆虫Spdpteralitura.中分散出来的一种新抗菌肽riin，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有广谱的抗菌活性。2.2抗真菌本

7、领20世纪90年代初，Iijia等从麻蝇幼虫血淋巴中初次分散出一种具有抗真菌活性，能按捺.albians生长的抗真菌肽。今后，很多具有抗真菌特性的抗菌肽也相继被分散出来，如从黑腹果蝇DrsphilaelangasterEigen中创造的抗菌肽drsyin等。GenBank数据表现，已经有30多种昆虫多肽被断定有抗真菌活性。昆虫抗真菌肽的创造，无疑为根治真菌熏染性疾病提供了新的有力本领。2001年，AndresE等6从鳞翅目昆虫烟蚜夜蛾Helithisviresens体内分散得到抗真菌肽ETD151，在临床预期实行中已经证明该抗真菌肽可以或许有用治疗真菌熏染性疾玻别的，有一些昆虫抗菌肽对真菌和细

8、菌具有双重抗性，如来自果蝇的ethikin对革兰氏阳性细菌和真菌均表示出抗菌作用，而从半翅目昆虫斑腹刺益蝽Pdisusauliventris中分散得到的thanatin那么对革兰氏阳性和阴性细菌以及丝状真菌都具有很强的抗菌活性。2.3抗肿瘤细胞的本领在肿瘤治疗时，化疗药物在抑杀癌细胞的同时，每每也会非特异性地抑杀正常细胞，产生较大的毒副作用。与此形成光显比拟的是，昆虫抗菌肽可以或许直接定位并作用于肿瘤细胞的质膜布局，引起胞内水溶性物质大量排泄，导致肿瘤细胞殒命，而对人体正常细胞那么无作用7。2022年，邱晓燕等8分散出两种分子量为4kDa和9.6kDa的抗菌肽，它们在较低浓度下就能有用按捺人胃

9、癌细胞G803和BG823、人乳腺癌细胞F7以及人肺癌细胞SPA1的体外增殖。作为肿瘤治疗性药物，抗菌肽无致畸变作用，无积蓄毒性，不轻易产生抗药性，因此抗菌肽极有大概成为无(或低)毒副反响的抗肿瘤新药。2.4抗原虫和病毒的本领昆虫抗菌肽对原虫和病毒如痢疾、疟疾、hagas氏并莱什曼病原虫等，以及伤风病毒、乙型肝炎病毒等也有必然作用。Sergeyhernysh等9从双翅目昆虫红头丽蝇alliphraviina中分散出一种抗菌肽allfern1对流感病毒A和B的疗效明显，可望进入临床实行；Parker和uh等10报道烟蚜夜蛾幼虫的血淋巴对6种DNA、RNA病毒有显着的广谱按捺作用；更令人欣喜的是，

10、ahinger等11创造天蚕素和蜂毒素在亚毒性浓度下可以或许按捺艾滋病毒HIV-1的基因表达，这一创造无疑为霸占艾滋病这一顽症提供了新的盼望。3昆虫抗菌肽基因工程研究盼望3.1昆虫抗菌肽基因的分子构成在鳞翅目lepidptera、膜翅目(hyenptera)以及包罗果蝇在内的双翅目diptera昆虫中,编码抗菌肽如天蚕素、防范素等的基因已经被乐成克隆，它们一样平常由2040个氨基酸残基构成。研究创造这些基因属于典范的真核基因，具有一个AAT框和一个TATA框，转录产物具有一个特异的帽子位点和多聚腺苷酸加尾信号序列(AATAA)，而且具有内含子和假基因。种种抗菌多肽在翻译后起首是从前体情势存在的

11、，其前体肽包罗一个信号肽序列、肽前体序列和成熟肽12，前体颠末卵白水解后产天生熟肽。差异的抗菌肽都存在守旧和可变序列，比来从伊蚊(Aedesaegypti)中分散得到的一个新天蚕素erpin，通过序列比对阐发创造它与果蝇体内分散的抗菌肽的同源性为37。而对防范素的研究创造，它们一样平常都存在6个守旧的半胱氨酸序列13，从差异昆虫体内得到的防范素成熟肽互相的相似性很高(均在90摆布)，此中家蝇usadestia与麻蝇(Sarphagaperegrina)防范素氨基酸序列的同源性高到达94。3.2昆虫抗菌肽基因的克隆及其表达随着分子生物学技能的生长，抗菌肽基因的克隆技能也在不竭的更新，人们可以使用

12、构建DNA文库并举行RT-PR扩增，或使用差异基因挑选技能选出熏染与未熏染的昆虫的差异表达基因，还可以依赖生物信息学的本领区分抗菌肽基因序列。如陈海旭等14使用RTPR技能克隆了果蝇抗菌肽dipteriin的DNA，其编码区长度为249bp，编码83个氨基酸，卵白分子量为9.0kD。王来城等15使用PR扩增得抵家蝇防范素基因前体的DNA片断全长430bp，此中开放阅读框为279bp，编码一个具92个氨基酸残基的短肽，分子量约为9.9kD，等电点为8.44；成熟肽DNA片断长119bp，由40个氨基酸构成，分子量为4.0kD，等电点为8.69，甘氨酸含量为20，而且含有防范素典范的6个半胱氨酸残

13、基；信号肽由22个氨基酸残基(122)构成，在体内从N末了切掉52个氨基酸残基，形成有活性的防范素(成熟肽)。在差异基因挑选要领上，刘振义等16使用差异表现反转录PR(DDRT-PR)技能对诱导和未诱导的家蚕总RNA举行差异表现阐发，得到了一条长约241bp片断，此基因在昆虫免疫反响中大概饰演紧张的脚色；2022年金小宝等17使用DDRT-PR技能对家蝇幼虫差异表达基因举行研究，从诱导后家蝇幼虫体内挑选出2条差异表达基因片断，长度别离为495bp和265bp，预计在家蝇免疫反响中起必然的作用。随着形式生物假设蝇等测序事情的日臻美满、生物信息学的不竭生长，研究职员将能使用基因组搜刮创造具有守旧布

14、局域的基因片断，进一步克隆出更多的昆虫抗菌肽新基因。基因重组技能是大量表达有活性抗菌肽的一条有用途径。如今抗菌肽的表达体系重要有大肠杆菌表达体系、酵母表达体系、杆状病毒介导的昆虫表达体系。在使用大肠杆菌表达抗菌肽时，必要思量表达产物对工程菌的毒性以及表达产物不变性等题目，对此，可以通过挑选抗性株系以及接纳交融卵白表达途径的计谋加以办理。如Jaynes等18于2022年将修饰过的天蚕素B基因以交融卵白的方法在大肠杆菌中表达，不单避开了对宿主的损伤作用，而且实现了高程度的表达。酵母表达体系是以酵母菌为宿主构建的表达体系，可有用地转录和翻译外源基因，较好地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等加工修饰历程

15、，较客不雅地表达天然卵白质的布局并维持其生物学活性。2022年，苏志坚等19用天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因构建成交融基因重组质粒，然后转化到酵母中举行表达，表达产物既有抗菌肽的抑菌活性，又有细胞生长因子的促进伤口愈合的本领。在杆状病毒介导的昆虫表达体系应用中，Hellers等20将编码天蚕素肽原的前体片断克隆至苜蓿歪纹蛾核型多角病毒启动子的卑劣，目的基因乐成地在重组熏染的粉纹夜蛾末龄幼虫和天蚕滞育蛹中表达，且产量很高。3.3昆虫抗菌肽基因工程研究中碰到的题目及办理方案昆虫抗菌肽奇特的良好性使人们越发致力于对它的研究，但是要得到足量的抗菌肽交换传统抗生素用于临床，还存在很多题目

16、有待办理。针对上述困难，应用当代基因工程技能，如突变体技能，交融卵白表达技能，展示技能，转基因动植物等举行的消费革新大概会成为人们得到药用抗菌肽有用的、具有潜力的途径。抗菌肽基因表达的研究最初是在原核表达体系中举行的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用及原核表达缺乏酰氨化成效，因此抗菌肽基因只能以交融卵白情势在E.li中表达，串联体表达是增长目的肽的表达服从的有用途径，是将肽抗生素基因一个紧接一个串联起来，此后插入相宜的表达载体中举行表达。如许，一方面借助串联体的空间折叠来屏蔽肽抗生素单体大概给工程菌带来的毒性，另一方面使用串联单体间卵白酶或化学裂解位点可将交融卵白落解成单体而大大进步表达物产率。如

17、Lee等21将蟾蜍肽抗生素bufrin基因毗连成串联体，效果多聚体在大肠杆菌中以包容体情势高程度表达，而且，其抗微生物活性与天然bufrin同等。这种多拷贝串联表达的形式不但明显进步了重组肽抗生素的产率，而且为其他小分子活性肽的表达制备提供了新思绪。别的，要得到天然基因表达的不变抗菌肽，用转基因动物猎取有杀菌活性的转基因产物将是一条抱负的途径。Yarus等24将小鼠乳清酸卵白基因AP调控序列与牛气管抗菌肽基因(TAP)构建的pAPbTAP交融基因注入小鼠原核期受精卵，乐成得到了pAPbTAP转基因小鼠，并从乳汁中得到了目的基因产物，体外试验证明，此种转基因产物对大肠杆菌具有杀伤作用。通过转基因

18、动物还可以进步动物抗病本领和熏抱病防治本领，Reed等25将小鼠IL-2基因与抗菌肽shivala基因和sV40多腺苷酸化剪接信号肽毗连构建的交融基因，注入小鼠原核期受精卵，效果该转基因老鼠对基因布鲁氏杆菌熏染抗菌本领显着加强。这使得应用抗菌肽相干基因对某些人类难治性疾病举行基因治疗不再成为空想。在转基因植物研究方面，Shara等26将天蚕肽erpinsB基因转入水稻，使用稻谷壳质酶信号肽使erpinsB排泄到细胞间隙,一方面庇护了目的肽免受细胞质中肽酶的落解，另一方面，得到了抗病本领加强的植株品系。随着对昆虫抗菌肽的种类、布局和作用机理的进一步探究，抗菌肽的基因工程研究将不竭深化，通过基因工

19、程技能改革抗菌肽基因布局，从而得到越发不变的高活力抗菌肽，必将促进其在各范畴的普及应用，具有极大的应用远景。4昆虫抗菌肽在医药中的应用远景抗生素的创造曾经为人类抗御疾病提供了有用本领。但是，随着抗生素的滥用，病原微生物也在变异和进化中不竭捕捉耐药本领，以致近些年不竭有“超等细菌的消息见诸报道。作为新一代天然抗生素，抗菌肽的作用机理差异于传统抗生素，它通过电荷中和的机制穿透细菌膜性布局杀死细菌，即它作用于靶“布局而非“成效，因此，极大地淘汰了靶菌株产生抗药性的大概性；别的，只管昆虫抗菌肽的有用活性浓度与传统的抗生素比拟相对较低，但是由于它具有抗菌谱广、种类多、对很多致病菌都具有显着有用的抗菌作用

20、，以及无致畸性、无积蓄毒性等特点，均使其作为现有抗生素大概的有用交换品而备受人类的青睐。如今，对抗菌肽的研发事情已经生长到疾病防治的各个范畴，一些抗菌肽已进入临床试验。美国马盖宁制药公司已挑选出一种源于蛙皮素againin的小肽SI-78，在期临床试验的926例糖尿病患者中，其对多种病原菌熏染引起的足溃疡均有明显疗效；在脑脊髓膜炎、人幽门螺旋杆菌熏染及抗真菌熏染等范畴抗菌肽已经进入了临床前期应用阶段27；德国粹者已将从果蝇体内提取的抗菌肽用于化疗和器官移植后出现的重度真菌熏染等治疗。在我国，一些抗菌肽作为临床新药已经得到了开端乐成，如用于治疗肾炎的“肾肝宁及容许作为类西药举行临床不雅察的乙型肝炎新药；而以抗菌肽作为消洗剂、治疗胃十二指肠溃疡及消化道炎症等新药的临床实行也正在举行中28。抗菌肽在新药开拓中越来越表示出宏大的应用潜力,并成为研究热门，随着新型抗菌肽的不竭创造以及基因工程改革抗菌肽的日趋美满，抗菌肽极有大概作为一种宁静有用的新型药物普及应用于医学临床范畴。5预测20世纪90年代后期以来，随着分子生物学技能在生物学和医学范畴的普及应用，某些昆虫抗菌肽的基因或DNA片断已经被连续克隆和分散出来，使得人们对抗菌肽的性子和特性有了进一步的相识29。研究创造，差异种类的昆虫所