基础与临床课件

1、53基因治疗的基础与临床研究北京大学临床肿瘤学院张珊文2007年11月 P53基因结构：p53基因定位于人染色体17p13.1区位，全长1620kb,有11个外显子和10个内含子，分子量为53KD的磷酸核蛋白，含393个氨基酸。功能：具转录因子的功能。野生型p53具细胞周期检查点功能，使受损细胞阻滞于G1期（或G2期）并引导细胞凋亡。突变型p53即丧失该功能，起癌基因作用。p53基因染色体定位p53基因结构功能：基因组保护神 第一部分研究 p53对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性的作用 国家自然科学基因课题（95规划） 4种不同p53状况胃癌细胞4Gy剂量照射后，仅wtp53细胞出现了明显的G1

2、期阻滞(分别占原细胞总数的67.9和61.1)，和细胞凋亡 (比例分别达13.0%和15.3%)。而其他3种p53异常的细胞都没有出现明显的G1期阻滞和凋亡效应。4种胃癌细胞4Gy照射后w细胞、M细胞、neo细胞和823细胞生存率分别为0.1080.006、0.1550.004、0.147 0.007和0.1400.013,W细胞生存率显著地低于后三种细胞（p0.05）4种胃癌细胞肿瘤10Gy照射后体积抑制曲线：w细胞肿瘤放射反应曲线明显受到抑制p53对人胃癌细胞热敏感性的作用4种不同p53状况胃癌细胞在42C 2 h 或43C 30min后8h，仅W细胞S期比例明显增加（P0.05）分别占5

3、3.5或50.0，凋亡比率分别达10.5%和12.3%。而其他3种细胞的S期比例无明显增高 ，凋亡比例都为0 (p0.05)。4种细胞种植肿瘤两次43C 20min加热后， w细胞肿瘤抑制曲线增长缓慢，到20天时仅增大了1倍，而其他3种细胞肿瘤增长迅速，到20天时增大了2.73.6倍,生长速度显著地高于W细胞（P0.05）。第二部分研究重组人p53腺病毒对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性作用作用机制Bax凋亡坏死重组腺病毒颗粒激活免疫系统产生细胞因子和淋巴细胞提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫力免疫系统作用机制转染率与病毒剂量 病毒量为50 MOI时，四种胃癌细胞感染率40%左右；100 MOI时，感

4、染率达8090%（multiplicity of infection, MOI,效靶比）。Adp53表达定位1:100MOI效靶比Adp53产生细胞高转染率（100）和p53基因在细胞内高表达，产生G2/M期阻滞和凋亡增加和细胞增殖抑制图1 100MOI Adp53感染4种胃癌细胞48小时后p53蛋白的免疫组化染色。Adp53感染细胞核着棕色。显示p53表达在细胞核内并达到100转染。1. Marker 2. W+Adp53 3. W control 4. M+Adp53 5. M control 6.neo+Adp53 7. neo control 8. 823+Adp53 9. 823 c

5、ontrol图2：Western blot印记法显示4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时，在53KD位置上均有一条清晰的杂交带，表明 p53蛋白高表达。 Wt Mut Neo BGC-823图3 . 4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时TUNEL法染色显示高比率凋亡细胞被染成棕色。表1 Adp53结合4Gy照射胃癌细胞存活率 存活分数 细胞系 Ad-p53组 4Gy组 p53+4Gy组 Wtp53 0.6260.019 0.1170.013 0.0940.001 Mutp53 0.3690.024 0.1690.002 0.0760.009 Neo 0.5180.016

6、 0.1520.004 0.1100.005 823 0.5260.023 0.1500.005 0.1080.025 注: 采用Hotelling T2 检验表明Ad-p53+4Gy组存活分数显著低于4Gy组（P0.001）Adp53结合放射实验 表2 Adp53结合4Gy照射对4种胃癌细胞的细胞周期和凋亡的影响（FCM法）细胞系 条件 G1 S G2/M Sub-G1 凋亡率比值Wtp53 对照组 48.25.0 29.64.0 22.24.0 4.91.1 Adp53 43.612.0 31.810.5 24.616.5 10.61.6 4Gy 61.04.2 25.19.9 13.97

7、.5 13.42.0 Adp534Gy 41.512.0 21.76.5 36.815.5 39.95.0 3.0#Mutp53 对照组 48.512.0 39.55.5 12.010.0 5.52.0 Adp53 40.32.0 38.716.0 21.010.0 17.93.2 4Gy 40.514.0 44.516.0 14.03.0 12.74.0 Adp534Gy 34.84.0 34.316.5 30.811.0 45.510.0 3.6Neo 对照组 44.05.0 33.36.5 22.75.0 7.02.5 Adp53 39.25.5 34.76.5 26.17.5 18.0

8、2.9 4Gy 43.09.0 30.27.5 26.86.5 11.45.0 Adp534Gy 29.78.0 36.27.5 34.19.5 25.12.5 2.2823 对照组 52.03.0 34.85.5 13.24.0 5.13.0 Adp53 42.54.0 39.82.0 21.66.0 15.84.8 4Gy 53.612.5 29.510.5 16.92.0 11.83.0 Adp534Gy 40.82.5 1.39.0 27.97.0 29.86.3 2.5 表3 Adp53结合4Gy照射4种胃癌细胞的凋亡率( TUNEL法) 凋亡率（%） 细胞系 对照组 Ad-53 4

9、Gy p53+4Gy 凋亡率比值 Wt-p53 1.0 18.00.5 12.02.0 40.02.5 3.3* Mut-p53 0.0 28.02.0 3.01.0 48.03.5 16.0 Neo 0.0 26.03.0 5.50.5 36.00.5 6.5 BGC823 0.0 25.04.0 5.01.0 35.01.5 7.0 *凋亡率比值Adp534Gy的凋亡率/单纯4Gy的凋亡率W细胞肿瘤Adp53对6Gy照射的抑瘤率比值为1.41,而对M细胞肿瘤为1.91。 图5.2示Adp53结合6Gy照射对M细胞肿瘤的抑制作用 图5.1示Adp53结合6Gy照射对W细胞肿瘤的抑制作用相对体

10、积相对体积 表1 Adp53结合加温对W细胞周期和凋亡的作用（FCM）条件 G1 S G2/M Sub-G1 热增效比对照 38.76.2 39.37.3 22.01.6 2.61.7Adp53 38.52.4 26.82.7 34.71.0 8.50.742C 2h 36.85.0 37.83.9 25.36.0 6.54.843C 0.5h 42.07.1 34.04.7 24.04.3 14.212.2Adp53+42C 2h 44.85.1 21.86.7 34.02.9 21.49.8 3.3Adp53+43C0.5h 35.82.1 40.57.6 23.87.1 22.512.2

11、 1.6 表2 Adp53结合加温对M细胞周期和凋亡的作用（FCM）条件 G1 S G2/M Sub-G1 热增效比对照 45.81.5 34.80.5 20.00.8 2.21.5Adp53 41.32.4 33.56.2 25.87.8 8.25.242C 2h 41.35.0 36.512.2 22.05.9 4.71.543C 0.5h 43.83.9 38.54.7 17.55.1 7.512.2Adp53+42C 2h 42.510.8 32.03.3 25.313.4 9.82.4 2.1Adp53+43C0.5h 41.52.5 36.39.9 22.512.5 13.30.5

12、 1.8 时间（天）图6.1 Adp53结合43C0.5h W细胞肿瘤抑制曲线 时间（天）图6.2 Adp53结合43C0.5h W细胞肿瘤抑制曲线相对体积 W细胞种植肿瘤相对生长曲线(见图6.1)：单纯43C 0.5h加温、单纯Adp53和Adp53结合43C 0.5h，肿瘤抑制率分别为15.8%、21.8%和27.2%,Adp53的热增效比为1.7。M细胞种植肿瘤相对生长曲线（见图6.2）：单纯加温、单纯Adp53和Adp53结合加温，肿瘤抑制率分别为24.2%、31.0%和37.8%，Adp53的热增效比为1.6。临床研究Gene Therapy dreamp53 基因放疗 野生型p53

13、促进放射线引发的细胞周期阻滞和凋亡。而变异p53 减弱甚至取消这种效应腺病毒介导p53恢复肿瘤细胞内p53的功能，提高肿瘤细胞放射敏感性。 试验材料重组人p53腺病毒注射液（今又生）今又生结构：E1基因缺失的携带人野生型p53基因的5型腺病毒Adp53 structure Gendicine is an E1 substituted replication-incompetent recombinant adenovirus encoding the human p53 gene.E1A/E1Bdeletionp53Structural proteinsE4E2E3病毒表面的蛋白质与细胞表面的

14、蛋白质通过“配子与配体”结合的方式，整个病毒颗粒被细胞吞噬入细胞内。在细胞浆内，病毒外壳与内核的DNA分离，其中外壳蛋白质被降解；DNA进入细胞核。在核内，DNA转录出RNA（mRNA), mRNA从胞核出来进入细胞浆；在胞浆翻译出 p53蛋白质， p53蛋白质通过内质网系统再进入到细胞核与核内的DNA结合，以调节DNA（基因）表达。P53基因治疗的临床机理瘤内注射今又生p53基因及其靶基因的表达治疗P53基因上调P21基因及Bax基因下调VEGF基因方法：IHC和RTPCR及测序免疫组化法评价今又生瘤内注射后p53基因表达.张子苑NPC例，注药前p53Adp53注射后p53 +75%刘凯恶性

15、神经鞘瘤例 注药前P53+75%,PCR+P53基因表达张沂择舌癌例，注药前P21张沂择注药后P2150丁先进NPC例，注药前P21丁先进注药后P21 25P21基因表达丁先进NPC，注药前Bax丁先进注药后Bax2550郑昌华NPC例，注药前Bax郑昌华例注药后Bax50%张沂择例注药后Bax25-50张沂择舌癌例注药前Bax丁先进NPC例注药前VEGF75丁先进例注药后VEGF马冰清平滑肌肉瘤例注药前VEGF75%马冰清例注药后VEGF张子苑例注药后VEGF25-50%张子苑NPC例注药前VEGF75%胃体癌，低分化腺癌（上图，疗前）VEGFP53灌注热化疗后手术，胃角残存肿瘤，镜下仅见间

16、质内散在稀少变性癌细胞VEGF今又生特有p53序列 331bp马冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用药前+75%,用药后+75% PCR法示：用药前，用药后注药前仅38吻合（如上图），注药后与p53专有序列比较100吻合（如下图）马冰清注药前与p53专有序列图比较仅38吻合马冰清注药后与p53专有序列图比较达100吻合例2： (龚兆洪NPC, IHC示)注今又生前样品p53与今又生专有p53序列仅有38吻合0720290_G1_P53F_B06_0721708:DNAMAN2 identity= 38%5 GTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCA

17、CCATCCA CT ACAAC 41 GTGGTGAGGCTCCCCTTTCTT GCGGAGATTCTCTTCC TCTGTGCGCCGGTCTCTC CCAGG65 TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATC101 ACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTCTTC125 ACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT 161 CAGTGTGATGATGGTGAGGAT

18、GGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACA185 GCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT221 CATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGGCAC245 CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAA 281 CACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACAC例1：注药后样品p53与今又生专有p53序列100吻合（IH

19、C示）0720299_G23_P53R_D09_0724712:DNAMAN1 identity= 100%1 CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC38 CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC61 AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC 98 AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACT

20、GGAGTC121 TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT 158 TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT181 ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG218 ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG241 CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTC

21、ATCCAAATACTCCACACGCAA 278 CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAAP53表达 IHC法 12/25(48%) RT-PCR+测序法 16/17 (94.1% ) P21表达 IHC法 11/25(44%)Bax表达 IHC法 9/24(37.5%) VEGF表达 IHC11/24(45.7%)瘤内注射Adp53后P53及其靶基因表达情况重组人P53腺病毒制剂临床试验1998年2000年1月完成临床I期试验2001年10月2003年5月完成II/III期临床试验北京肿瘤医院为牵头单位李利华，鼻咽癌，右颈

22、转移 ,T2N2M0右上颈转移淋巴结6.1cm2纤维鼻咽镜可见右鼻咽顶3cm肿物疗前CT示右鼻咽顶肿物5.5cm2病理：低分化鳞癌方法1右上颈肿物B超探查右上颈肿物注射部位大小 6.1cm2右上颈肿物，6.8 cm2，注射今又生B超引导下，右上颈肿物穿刺注射今又生可见针尖位置在瘤内注药后即刻在瘤内形成一片强回声区方法2左：左侧鼻咽顶肿瘤 右：直接瘤内注射今又生光纤鼻咽内镜引导下瘤内注射今又生左下图：60Gy，8次注今又生，鼻内镜见左鼻咽顶肿瘤消失 各种给药途径瘤内注射的意义1.避免免疫攻击2.腺病毒感染快而广3.高感染率致高疗效分组方案多中心随机对照II/III期临床试验基因放疗组（GTRT）

23、单纯放疗组（RT）方案 基因放疗组（GTRT）每周5瘤内注射今又生1012VP/次，第三天放疗，病灶区采用与RT组相同照射,予70Gy/35f/78w, 第五周(40Gy) ，第八周(70Gy) ，疗后2个月为疗效确认，以CT测量肿瘤体积，计算40Gy、70Gy、和确认时肿瘤缩小率（）.按WHO实体肿瘤客观疗效评定标准，疗效评定为CR、PR、SD、PD。 实验室特殊检查肿瘤组织p53蛋白检测（IHC法和测序法）病毒抗体检测（ELASA法）临床常规检验每周血、尿、便每月血生化（BUN,Cr,AST,ALT)每月心电图、胸片毒性反应按WHO常见毒性分级标准评价毒付反应，按轻、中、重、威胁生命评价和

24、记录。重点观察体温变化。一般在注射今又生后几小时内出现短暂的自限性发热（self-limited fever），38C以上发烧者可酌情给予退烧药（消炎痛栓或柴胡注射液）。统计学分析全部数据的统计分析，采用SPSS11.0 统计软件，瘤灶缩小率比较采用t检验（两组方差不齐时，用t检验），疗效比较采用Pearson卡方检验，不良反应测定值与基线比较采用Dunnett-t检验。GTRT group ( n=26)RT group ( n=27 )Gender (n) Male FemaleAge ( y ) Median RangeHistologic type KeratinizingUndiff

25、erentiated UICC stage (n) I II III IV (M0)17948.512.4197042208 (30.8)8 (30.8)10 (38.4)19851.611.3287132409 (33.3)10 (37.1)8 (29.6)Table 1. Comparison of patient characteristics between GTRT and RT groups* Data presented as the number of patients, with the percentages of the total in parentheses. 表2

26、鼻咽癌GTRT组26例和RT组27例瘤灶大小（mm2）比较组别瘤灶数肿瘤大小GTRT组26 676.15437.84mm2RT组44 645.91448.97mm2GTRT组瘤灶大于RT组，但成组t检验：Z=-0.271 , p=0.787 , 两组瘤灶大小差别无统计学意义，说明两组疗效具有可比性。GTRT组与GT组具可比性性别构成、年龄、病理、肿瘤大小、临床分期均无显著差别鼻咽癌T2N2M0, III, 疗前肿瘤 23.5cm2 充满鼻咽和鼻腔照射40Gy 结合 6 次注射今又生后肿瘤完全消失Left upper fig： NPC stage IV pretreatmet Nasophary

27、ngeal tumorNaso-endoscope photoUpper fig: pretreatInferior fig: at 44Gy and 5 times injection tumor disappeared. CT imaging at 70GY and Gendicine 8 times，nasopharynx tructure normalTable 3. Tumor shrinkage rates (%) of Gendicine-injected tumors of GTRT group as compared with RT group 40Gy 70Gy ValidationGTRT 64.5017.78# 84.3516.97# 90.2721.15# RT 41.5324.59# 56.6028.01# 72.5023.17# RER*1.551.49 1.25# Tumor shrinkage rate (%) (X S)Radio-enhancement ratio ( RER ) tumor shrinkage rate of Gendicine-injected tumor of GTRT group/tumor shrinkage rate of tumor of RT groupP0.01 for each treatment po